БИОХИМИЯ, 2008, том 73, вып. 6, с. 893 - 902
УДК 612.115.12
АКТИВИРОВАННЫЙ ПРОТЕИН С ЧЕРЕЗ РЕЦЕПТОР PAR1 РЕГУЛИРУЕТ ВЫЖИВАЕМОСТЬ НЕЙРОНОВ ПРИ ГЛУТАМАТНОЙ ЭКСАЙТОТОКСИЧНОСТИ
© 2008 Г. Л.Р. Горбачева1, Т.П. Сторожевых2, В.Г. Пинелис2, О.Н. Давыдова2, С. Ишивата3, С.М. Струкова1*
1 Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992 Москва, электронная почта: sstrukova@yahoo.com 2 ГУ Научный центр здоровья детей РАМН, Москва, Россия
3 Department of Physics, School of Science and Engineering, Waseda University, Tokyo, Japan; E-mail: ishiwata@waseda.jp
Поступила в редакцию 01.10.07 После доработки 12.11.07
Исследовано влияние антикоагулянтной и цитопротекторной сериновой протеиназы крови — активированного протеина С (АРС), на выживаемость культивируемых гиппокампальных и кортикальных нейронов при эксайтотоксичности, вызванной глутаматом. Показано, что АРС в низких концентрациях (0,01—10 нМ) не вызывает гибели нейронов, но в узком диапазоне низких концентраций существенно (в 2 и более раз) снижает гибель клеток от токсического действия глутамата. АРС в высоких концентрациях (>50 нМ) вызывает гибель гиппокампальных нейронов, подобную токсическому действию глутамата. Показано, что протекторное действие АРС на нейроны реализуется через расщепляемый рецептор типа 1, активируемый проте-иназами (PAR1), поскольку инактивация фермента фенилметилсульфонилфторидом (PMSF) или блокада PAR1 пептидом — антагонистом PAR1 ((Tyr')-TRAP-7) отменяла протекторное действие АРС. Кроме того АРС блокировал проапоптотическое действие 10 нМ тромбина на нейроны. Гелданамицин, специфический ингибитор белка теплового шока HSP90, полностью отменял анти-апоптотическое действие 0,1 нМ APC на гиппокампальные нейроны при цитотоксичности, вызванной глутаматом. Таким образом, показано, что APC в низких концентрациях, активируя PAR1, защищает гиппокампальные и кортикальные нейроны от гибели при глутаматной эксайтотоксичности.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: Активированный протеин С, глутаматная токсичность, апоптоз, гиппокампальные и кортикальные нейроны, рецептор, активируемый протеиназами, гелданамицин.
Активированный протеин C (АРС) — узкоспецифичная сериновая протеиназа семейства трипсина, образуется в фазе инициации свертывания крови в результате ограниченного протеолиза протеина С крови тромбином, связанным с тром-бомодулином эндотелия [1, 2]. Активация протеина С (РС) комплексом тромбин—тромбомоду-лин существенно ускоряется при связывании РС с рецептором на эндотелии сосудов — эндотели-альным рецептором протеина С (EPCR) [3, 4]. АРС блокирует образование тромбина на ранней стадии свертывания крови с помощью механизма
Принятые сокращения: PAR — рецептор, активируемый протеиназой; PAR1-AP — пептид — агонист PAR1; HSP90 — белок 90 теплового шока, PMSF — фенилметил-сульфонилфторид, PC — протеин С, APC — активированный протеин С, EPCR — эндотелиальный рецептор протеина С.
* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.
отрицательной обратной связи, поскольку инак-тивирует необходимые кофакторы свертывания крови: факторы Va и VIIIa, специфично гидроли-зуя в каждом по три пептидные связи [4—7].
АРС — мультифункциональный фермент, участвует в регуляции свертывания крови, а также воспаления и апоптоза, проявляя антивоспалительные и цитопротекторные свойства [7—10]. Рекомбинантная форма АРС (дротреко-гин а) снижает смертность пациентов от тяжелого сепсиса [11—13]. АРС ингибирует апоптоз и блокирует воспаление, изменяя профиль экспрессии генов [14, 15], и регулирует дисфункцию эндотелия, снижая образование провоспа-лительных цитокинов активированными моноцитами [16—18]. АРС защищает кортикальные нейроны от гибели в моделях NMDA- и стауро-спорининдуцированного апоптоза [19].
Молекулярные основы антивоспалительного и антиапоптотического действия APC еще не
выяснены окончательно. APC индуцирует про-тективные гены в эндотелиальных клетках, действуя либо через активацию EPCR [20—22], либо через каскад рецепторов EPCR-PAR1 [23]. Есть данные об участии в нейропротекции рецепторов подтипов PAR1 и PAR3 при NMDA- и стауроспорининдуцированном апоптозе нейронов [19].
Исследования экспрессии PAR нейронами и участия PAR в действии APC на клетки представляются весьма перспективными для выяснения механизмов влияния фермента на выживаемость/гибель нейронов при эксайтотоксичнос-ти. Известно, что гиперстимуляция глутаматных рецепторов ведет к гибели нейронов и является универсальным пусковым механизмом развития нейродегенеративного процесса при эксайто-токсичности. Первичная культура нейронов — это удобная экспериментальная модель для изучения нейродеструктивных процессов, вызываемых глутаматом (цитологические и биохимические характеристики культивируемых нейронов близки тем, что наблюдаются у нейронов in situ) [24]. К настоящему времени нет достаточно данных о роли АРС в выживаемости нейронов при индуцированной глутаматом гибели. Ранее мы показали, что при глутаматной эксайтоток-сичности тромбин (в концентрации 1—10 нМ), активируя PAR1, защищает гиппокампальные нейроны, хотя в высокой концентрации (более 10 нМ) тромбин сам может вызывать гибель нейронов [25]. Показано, что специфический ингибитор белка теплового шока (HSP90) гелда-намицин блокирует вызванное тромбином изменение цитоскелета астроцитов, хотя в отсутствии фермента не влияет на морфологию клеток. [26]. Обнаружено специфическое взаимодействие С-конца молекулы PAR1 с цитозоль-ной формой HSP90 в дрожжах [26, 27].
В работе исследовано влияние APC на культивируемые нейроны гиппокампа [28] и коры мозга в норме и при глутаматной эксайтоток-сичности и показано, что антиапоптотическое действие АРС на нейроны реализуется через PAR1 и HSP90.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Получение культуры гиппокампальных и кортикальных нейронов. Исследования проводили на первичных культурах нейронов гиппокампа (9—10 дней) или коры (7—8 дней), извлеченных из мозга одно-трехдневных крысят линии Вис-тар. Суспензию клеток (106 клеток/мл) получали по ранее описанному методу [29] и переносили на покровные стекла (в объеме 200 мкл на 1
стекло), покрытые поли-Б-лизином (10 мг/мл). Через 1 ч (37°, 5% СО2) удаляли неприкрепив-шиеся клетки и добавляли 1,5 мл культуральной среды (нейробазальная среда — А, содержавшая 2% Supplement B-27 и 0,5 мМ L-глютамина). На 3—4 день добавляли арабинозид (ARAC, 10-5М) на сутки для подавления роста глиальных клеток.
Оценка гибели нейронов. Гибель нейронов в культуре определяли через сутки после 30 мин действия глутамата (100 мкМ) и исследуемых веществ, которые добавляли к клеткам, сменив временно культуральную среду на Hepes-солевой буфер. Состав буфера в мМ: NaCl - 145, KCl - 5, CaCl2 - 1,8, MgCl2 - 1,0 (без MgCl2 в случае экспозиции клеток с глутаматом); глицин - 0,01; Hepes - 20, глюкоза - 5 (рН 7,4). Гибель оценивали двумя способами: биохимическим (MTT-(3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) метод) [30] и морфологическим. Водный раствор МТТ добавляли в культу-ральную среду до конечной концентрации 1 мг/мл и инкубировали клетки 3 ч при 37°. Затем среду отбирали и добавляли DMSO для растворения формазанов. Поглощение измеряли при 590 нм на универсальном микропланшетном спектрофотометре Anthos Lucy-1. Оценивали результаты в процентах по отношению к контролю. Морфологическая оценка гибели нейронов включала исследование ядерной фрагментации и конденсации хроматина с помощью флуоресцентного ДНК-тропного красителя Hoechst 33342 (абсорбция 360 нм, эмиссия 460 нм), который свободно проникает в живые клетки и соединяется с поврежденной, фрагментарной ДНК [31] и витального красителя SYTO-13 (абсорбция 488 нм, эмиссия 590 нм) [32]. В окрашенных Hoechst 33342 клетках визуально оценивали состояние ядра с использованием микроскопа Axiovert 200 («Zeiss», Германия). Клетки с пикнотическими и неправильной формы ядрами относили к апоптотическим и количество таких клеток выражали в процентах по отношению к общему количеству клеток.
В каждой серии экспериментов одна выборка состояла из 5-7 независимых экспериментов, в каждый из которых входило 2-3 образца сестринских культур. На каждом стекле проводили подсчет 200-500 клеток в 8-10 полях. Количество апоптотических нейронов выражали в процентах по отношению к общему количеству клеток.
Регистрация внутриклеточной концентрации кальция ([Ca2+]j). [Ca2+]j измеряли методом флуоресцентной микроскопии с помощью высокоаффинного флуоресцентного индикатора Fura-2. Клетки загружали проникающей сквозь мем-
браны формой (Fura-2/AM, 5 мкM, 40 мин, при 26°), смешанной с неионным детергентом Pluronic F-127 (0,02%; Molecular Probes, CШA), затем культуры отмывали Hepes-солевым буфером. Отекло с клетками помещали в перфузион-ную камеру объемом 0,2 мл, смонтированную на столике инвертированного микроскопа (Axio-vert 200, «Zeiss»). Флуоресценцию Fura-2 возбуждали, облучая клетки поочередно светом с длинами волн 340 и 380 нм в течение 100—200 мс, с интервалом 10 с; эмиссию регистрировали в диапазоне 505—535 нм. Изображения клеток получали с помощью охлаждаемой CCD-камеры («Roper Scientific, CoolSnap-fx», CШA). Цифровую запись эксперимента и обрабатку данных осуществляли с помощью компьютерной программы Metafluor 6.1 («Universal Imaging Corp.», CШA). Aбсолютные значения [Ca2+]i определяли, используя калибровочные растворы по методике [33]. Все измерения проводили при комнатной температуре (22—26°).
Обратная транскрипция (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для выделения тотальной PHK использовали набор SV Total RNA Isolation System («Promega», CШA) и лизировали 4 • 106 нейронов на пробу. Этап обработки ДHKазой проводили в процессе выделения на колонке. Для проведения обратной транскрипции использовали RevertAid™ First Strand cDNA Synthesis Kit («Fermentas», Литва), согласно протоколу фирмы.
ПЦP проводили в конечном объеме 25 мкл, содержащем 2,5 мкл реакционного буфера (x10) (670 мM Tris-HCl, pH 8,8, 166 мM (NH4)2SO4, 0,i% Tween 20, 25 мM MgCl2), 0,5 м^ каждого праймера, 0,5 мкл dNTP (5 мM), 0,5 мкл Hot-rescue ДHK-полимеразы с блокирующими активность фермента антит
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.