МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 1, с. 27-36
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.8.043:615.33.015.46
АКТИВИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ АЗИТРОМИЦИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ БИОПЛЕНОК И БОРЬБА С ЭТИМ ЯВЛЕНИЕМ © 2015 г. С. В. Мартьянов, М. В. Журина, Г. И. Эль-Регистан, В. К. Плакунов1
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 30.05.2014 г.
Рост биопленок сапротрофных штаммов большинства изученных грамположительных (представителей родов Dietzia, Kocuria, Rhodococcus) и грамотрицательных бактерий (представители родов Pseudomonas, Chromobacterium) оказался значительно более устойчивым по сравнению с ростом планктонных культур этих штаммов к действию азитромицина — антибиотика, ингибитора трансляции. Обнаружено явление стимуляции процесса формирования биопленок у изученных сапротрофных микроорганизмов низкими концентрациями азитромицина. При этом скорость синтеза полисахаридного компонента матрикса превышает размножение микробных клеток, что подтверждает реализацию в этих условиях "биопленочного" фенотипа. Установлено, что представитель класса алкилоксибензолов (АОБ) — 4-гексилрезорцин обладает способностью примерно в равной степени подавлять рост как планктонных культур, так и биопленок изученных штаммов сапротрофных бактерий. При совместном действии азитромицина и АОБ в некоторых случаях наблюдается аддитивный ингибиторный эффект, а главное, предотвращается стимуляция роста биопленок в присутствии низких субингибиторных доз азитромицина, что позволяет рассматривать АОБ как перспективное "антибиопленочное" средство.
Ключевые слова: биопленки, антибиотики, активация формирования биопленок, борьба с формированием биопленок, алкилоксибензолы, 4-гексилрезорцин.
DOI: 10.7868/S0026365614060123
Явление стимуляции формирования биопленок у патогенных микроорганизмов низкими концентрациями антибиотиков привлекает все большее внимание [1—3].
Ранее нами описано стимулирующее действие субингибиторных концентраций антибиотиков на формирование биопленок у некоторых грамположительных нефтеокисляющих бактерий [4]. Совпадение эффектов, оказываемых субингиби-торными уровнями антибиотиков на патогенные и сапротрофные бактерии, не представляется самоочевидным и требует специальных исследований. Эволюция патогенных микроорганизмов протекает в тесном контакте с макроорганизмом, который они инфицируют, и залогом их успешного размножения служит выработка механизмов противодействия защитным силам макроорганизма, а также антибиотикам — веществам, используемым для химиотерапии инфекций. Не удивительно, что биопленки патогенов высоко устойчивы к антибиотикам, а досрочное прекращение анти-биотикотерапии и снижение концентрации антибиотиков в макроорганизме до субингибиторных
1 Автор для корреспонденции (e-mail: plakunov@inmi.host.ru).
уровней может приводить к активации процесса формирования биопленок.
Обитающие в почве, водоемах или в подземных экосистемах сапротрофные микроорганизмы, как правило, не встречаются с антибиотиками, по крайней мере, в тех их концентрациях, которые используются в химиотерапии. Поэтому устойчивость их биопленок к антибиотикам не является фактором, жизненно необходимым для выживания. Следовательно, эта устойчивость свидетельствует об общебиологическом характере данного явления, обусловленного свойствами биопленок, а не условиями их существования. Даже если представить, что сапротрофные микроорганизмы приобрели такую устойчивость путем горизонтального переноса генов от патогенных микроорганизмов, реализация этой способности вне зараженного макроорганизма только подтверждает соображения о общебиологическом характере данного явления.
Что касается механизма стимуляции антибиотиками формирования биопленок, то единого мнения по этому вопросу в научной литературе не существует. В ряде исследований обнаружено влияние низких концентраций антибиотиков на адгезию бактерий к твердой поверхности. Так, на-
пример, показано [2], что субингибиторные концентрации имипенема, антибиотика группы карба-пенемов, подавляющего синтез клеточной стенки бактерий, повышают адгезию клеток Acinetobacter baumannii к полистиролу.
Показано, что антибиотик тобрамицин в субингибиторных концентрациях усиливает образование биопленок штаммом Pseudomonas aerugi-nosа PAO1 [5]. Однако другие авторы показали, что субингибиторные концентрации тобрамицина подавляют N-ацетилгомосеринлактон (АГЛ)-зависи-мую систему "quorum sensing" (QS) у штамма PUPa3 P. aeruginosa, приводя к снижению биоплен-кообразования [6].
Наряду с этим существуют гипотезы, связывающие активирующее действие тобрамицина на формирование биопленок с уровнем циклодигуа-нозинмонофосфата (с-di-GMP) [7]. Синтез и деградация этого вещества осуществляется ферментами дигуанилатциклазой (DGC) и фосфодиэсте-разой (PDE) соответственно. Как положительная, так и отрицательная регуляция многих биохимических процессов реализуется путем связывания c-di-GMP с регуляторными белками, что приводит к изменению их конформации, сопровождающейся воздействием на клеточные процессы. В частности, установлено, что переход бактерий от планктонного фенотипа к биопленочному регулируется белками с DGC и PDE-активностью. Так, биопленки, образуемые мутантом P. aeruginosa c повышенным содержанием c-di-GMP, плохо созревают и не подвергаются диспергированию. Существует предположение, что уровень этой сигнальной молекулы в клетке постепенно снижается по мере созревания биопленки. Также посредством c-di-GMP регулируется синтез экзопо-лисахаридов у ряда патогенных микроорганизмов. Регуляторные пути, зависимые от системы QS и от c-di-GMP, не связаны между собой напрямую, однако могут сопрягаться косвенно. Например, QS-регулируемый фактор транскрипции AphA у Vibrio choleraе влияет на экспрессию генов, кодирующих DGC и PDE.
Другие исследователи также обнаружили, что индукция биопленкообразования под действием субингибиторных концентраций аминогликозидов у P. aeruginosa происходит с участием c-di-GMP. Ген arr (регулятор, зависящий от аминогликозидов) кодирует PDE. Соответственно, в клетках, му-тантных по гену arr, активность данного фермента снижена, и параллельно возрастает чувствительность таких клеток к тобрамицину. Показано, что при добавлении гуанозинтрифосфата (GTP), который ингибирует активность данной фосфо-диэстеразы, наблюдается подавление образования биопленок [1].
Вышеперечисленные данные говорят о невозможности в настоящее время сформулировать об-
щую закономерность влияния низких концентраций антибиотиков на формирование биопленок, следовательно, этот феномен требует дальнейшего изучения.
Целью данной работы было выявить наличие или отсутствие феномена стимуляции биоплен-кообразования низкими концентрациями антибиотика азитромицина у ряда ранее не изученных грамположительных и грамотрицательных бактерий и проверить возможность избирательного подавления формирования биопленок.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Объектами исследования послужили чистые культуры грамположи-тельных нефтеокисляющих бактерий Kocuria rhizophila и Dietzia natronolimnaea, изолированные из пластовых вод Ромашкинского нефтяного месторождения, а также Rhodococcus equi, выделенный из почвы населенного пункта Хоа Лак, Вьетнам. Для сравнения взяты модельные грамотри-цательные бактерии: Pseudomonas chlororaphis 66, а также Chromobacterium violaceum WT (типовой штамм ATCC 31532) и его мутант CV026. Эти штаммы любезно предоставлены профессором И.А. Хмель (Институт молекулярной генетики РАН). У мутантного штамма инактивирован ин-серцией транспозона mini-Tn5 ген синтазы cviI, которая отвечает за синтез АГЛ.
Культивирование и хранение микроорганизмов.
Микроорганизмы сохраняли на среде LB в столбиках под вазелиновым маслом при 4—6°C кроме культур Chromobacterium, которые хранили при комнатной температуре (мутант CV026 в присутствии 100 мкг/мл канамицина). Для приготовления инокулята бактерии выращивали на среде LB при 29°C на качалке (150 об/мин) в течение 20—24 ч. Эти культуры использовали как инокулят в опытах с биопленками.
Получение биопленок и изучение их чувствительности к ингибиторам. Для сравнения чувствительности планктонных культур и биопленок к антибактериальным веществам и физико-химическим факторам среды использовали разработанный в лаборатории метод с использованием тефлоновых блочков [4]. В этом случае для формирования биопленок в пробирки с 3 мл среды LB помещали 3 г тефлоновых блочков (размер 4 х х 4 х 4 мм), и после стерилизации при 1 ати вносили инокулят (обычно 50—60 мкл). На тефлоно-вых блочках происходило формирование биопленок, планктонные (суспензионные) культуры развивались в той же пробирке в жидкой среде. После завершения инкубации планктонную культуру отделяли и ее рост измеряли по величине условной оптической плотности (светопоглощение + светорассеяние) при 540 нм. Блочки отмывали от
планктонных клеток 1% раствором NaCl, биопленки фиксировали 96% этанолом. После удаления спирта окрашивание биопленок производили 0.1% водным раствором красителя кристаллического фиолетового (КФ) по 3 мл на пробирку. В параллельных опытах для окрашивания матрикса биопленок использовали краситель 1,9-диметилметиле-новый синий (1,9-dimethylmethylene blue, DMMB) по модифицированной нами методике [8]: сухую навеску красителя из расчета 160 мкг/мл растворяли в буфере (200 мг формиата натрия + 200 мкл конц. муравьиной кислоты на 100 мл воды), рН 3.0, по 3 мл на пробирку. КФ экстрагировали 96% этанолом, а DMMB декомплексирующим раствором (1.64 г ацетата натрия + 152.85 г гуанидин хлорида + 40 мл изопропанола на 400 мл воды), рН 6.8. Оптическую плотность растворов измеряли при 590 нм (в случае КФ) или при 670 нм (для DMMB).
Чувствительность к антибиотикам и 4-гексилре-зорцину. Чувствительность планктонной культуры к ингибитору характеризовали его концентрацией, подавляющей на 50% скорость роста культуры (ИД50) через 24 ч инкубации при 28°C) в пробирках на качалке (150 об/мин). Исходный раствор азитромицина (25 мг/мл) готовили в 96% этаноле, а исходный раствор 4-гекси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.