ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 2, с. 177-186
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
АКТИВНОСТЬ ДЫХАТЕЛЬНЫХ ПУТЕЙ И ФОНД НЕСТРУКТУРНЫХ УГЛЕВОДОВ В ЛИСТЕ ЗЕЛЕНЕЮЩИХ ПРОРОСТКОВ ЯРОВОЙ
ПШЕНИЦЫ
© 2014 г. Е. В. Гармаш, Р. В. Малышев, М. А. Шелякин, Т. К. Головко
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар
Поступила в редакцию 26.12.2012 г.
Исследовали динамику дыхания, соотношение дыхательных путей и их связь с содержанием растворимых углеводов в листе проростков яровой пшеницы (Тпйеыт аезйуыш Ь.) при зеленении на непрерывном свету (ФАР 190 мкмоль/(м2 с)) в течение 48 ч. Изменения дыхания листа в процессе де-этиоляции были тесно связаны с модуляцией активности альтернативного пути (АП). Скорость ци-тохромного дыхания (ЦП) прямо зависела от содержания углеводов и скорости роста. Это позволяет заключить, что во время зеленения субстратная регуляция активности ЦП опосредована энергетическими потребностями процессов роста и эффективно осуществляется с помощью механизма дыхательного контроля. Максимальные значения скорости АП были зарегистрированы спустя 6 ч экспозиции проростков на свету. Соотношение ЦП/АП в этот период было близко единице. Активность АП в процессе деэтиоляции изменялась независимо от содержания растворимых углеводов, что указывает на существование, помимо субстратной регуляции, других более сложных механизмов вовлечения АП. Наши результаты свидетельствуют в пользу представлений об участии альтернативного пути дыхания в поддержании гомеостаза фототрофных клеток в период становления фотосинтетической функции.
Ключевые слова: Тпйеыт ае5Нуыт — деэтиоляция — альтернативное дыхание — цитохромное дыхание — углеводы — рост
DOI: 10.7868/S0015330314020043
ВВЕДЕНИЕ
Лист как специализированный орган фотосинтеза обеспечивает растение восстановленным углеродом и энергетическими эквивалентами (НАД(Ф)Н, АТФ). Часть запасенной в ассимиля-тах энергии извлекается при дыхании и используется на рост и поддержание функциональной активности и целостности клеточных структур. Углеводы могут влиять на дыхание прямо (как
Сокращения: АО — альтернативная оксидаза; Дт — активность темнового дыхания, измеренного по скорости выделения СО2; ИРП - интенсивность радиации приспособления; ОСР - скорость роста листа; СГК - салицилгидроксамовая кислота; ТБК-РП — реагирующие с тиобарбитуровой кислотой продукты; Фв — скорость видимого фотосинтеза; ЦП, АП — цитохромный и альтернативный путь дыхания соответственно; Ту^ — максимальный квантовый выход ФС II; дР, дК — фотохимическое и нефотохимическое тушение флуоресценции хлорофилла соответственно; К^, Кд — активность ЦП и АП соответственно; V — активность темно-вого дыхания, измеренного по скорости поглощения О2. Адрес для корреспонденции: Гармаш Елена Владимировна. 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28. Институт биологии Коми научного центра УрО РАН. Факс: 007 (8212) 24-01-63; электронная почта: garmash@ib.komisc.ru
дыхательные субстраты) и опосредованно — через энергопотребляющие процессы и, прежде всего, рост [1]. Поэтому важную роль в регуляции связи дыхательной активности растений с углеводами играет дыхательный контроль (соотношение АТФ/АДФ и НАДН/НАД+). Механизм дыхательного контроля, регулирующий скорость синтеза АТФ в зависимости от энергетических нужд, функционирует не только на клеточном уровне, но и на уровне ткани [2, с. 5].
В ЭТЦ митохондрий перенос электронов с пула убихинона осуществляется по основному ци-тохромному (ЦП) и нефосфорилирующему альтернативному (цианидрезистентному) пути (АП) через альтернативную оксидазу (АО). Влияние углеводов на АП является предметом дискуссии с тех пор, как была выдвинута гипотеза "сверхпотока" ("energy overflow") [3]. Согласно этой идее, АП участвует в окислении избытка углеводов в тканях, а в современной интерпретации — в регуляции баланса между углеводным метаболизмом и скоростью транспорта электронов [4]. Считается, что вовлечение АП стабилизирует окисли-
тельно-восстановительный баланс в митохондри-альной ЭТЦ за счет быстрого окисления НАДН и препятствует генерации избыточного количества АФК [4, 5 и др.]. В фотосинтезирующих листьях на свету АП может участвовать в окислении восстановительных эквивалентов, поступающих из хлоропластов в митохондрии посредством малат-оксалоацетатного челнока, способствуя тем самым "разгрузке" ЭТЦ хлоропластов [6]. Экспрессия генов АО индуцируется светом через фоторецепторы или через механизмы, связанные с активацией фотосинтетического метаболизма и изменением пула углеводов [7]. Наблюдаемое в ряде исследований усиление активности АП при экспозиции растений к повышенной освещенности авторы объясняли увеличением содержания углеводов [8—11]. В других экспериментах такая зависимость не была обнаружена [8, 9]. Важно отметить, что эти исследования были проведены преимущественно на зрелых листьях со сформированным мезофиллом, и эффект углеводов на АП часто зависел от отношения растения к световым условиям среды, степени их светолюбия или теневыносливости.
Сведения о регуляции дыхательных путей и вовлечении АП при зеленении, в процессе которого осуществляется становление фотосинтетического аппарата и переход листа на фототроф-ный тип питания, очень скудные. В работе [12] было показано, что повышение активности АП в семядолях сои при зеленении в условиях нормального фотопериода не связано с изменением их углеводного статуса. Следует отметить, что семядоли сои являются запасающими органами. Основную часть их запасных веществ составляют белки и липиды (триацилглицериды) [13]. При прорастании семян и формировании проростков белки семядолей гидролизуются до аминокислот, а липиды с участием липаз распадаются на глицерол и жирные кислоты, которые подвергаются Р-окисле-нию, метаболизируются в глиоксалатном цикле и глюконеогенезе с образованием сахаров. Все это существенно усложняет выявление связи дыхания с углеводами при деэтиоляции.
Цель данной работы заключалась в выявлении закономерностей изменения дыхательной активности и анализе связи дыхательных путей с углеводным статусом формирующегося первого листа проростков пшеницы в процессе деэтиоляции на постоянном свету. Круглосуточное освещение использовали, чтобы избежать флуктуаций концентрации сахаров, обусловленных сменой дня и ночи.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Семена пшеницы (ТгШеыт агзИуыт Ь., сорт Иргина) в течение суток замачивали в воде при комнатной температуре. Затем семена промывали, сливали воду и оставляли еще на сутки во
влажной камере в темноте. Двухсуточные проклюнувшиеся семена распределяли на рамки с сеткой, помещали на кюветы объемом 3 л с 1/2 нормы раствора Кнопа и проращивали в течение четырех суток в климатической камере ("Binder", Германия) в полной темноте при 21 °С и влажности 60%. На пятые сутки включали лампы, и этиолированные проростки оставляли под непрерывным светом (ФАР 190 мкмоль/(м2 с)) в течение 48 ч. В отдельном эксперименте проростки после 6 ч деэтиоляции помещали в условия длительной темноты (18 ч), чтобы уменьшить фонд углеводов. Для исследований отбирали среднюю часть листовой пластинки первого листа четырех- и пяти-суточных этиолированных проростков спустя 1, 2, 4, 6, 12, 24 и 48 ч их экспозиции на свету. Всего было проведено три независимых серии экспериментов.
Рост листа оценивали по накоплению биомассы. Пробы (первый лист 20 проростков) взвешивали и высушивали до воздушно-сухого состояния при 70°С. Относительную скорость роста листа (ОСР, г/(г сухой массы ч)) определяли, как разность натуральных логарифмов массы листа в разные периоды времени [14].
Определения СО2-газообмена (видимый фотосинтез, Фв, или выделение СО2 интактными листьями в темноте, Дт) проводили в открытой системе с помощью подключенного по дифференциальной схеме инфракрасного газоанализатора Li-7000 ("Li-COR Inc.", США). Среднюю часть пластинки 4-5 интактных листьев площадью 0.25-0.30 дм2 помещали в термостатируемую листовую камеру объемом 30 см3, через которую прокачивали воздух со скоростью 60 л/ч. Температуру в камере (20 ± 2°С) контролировали, используя микротермистор МТ-54 с неравновесным мостом НМ-31 (Россия). Камеру освещали лампой ДРЛФ (Россия) мощностью 1 кВт.
Величину Фв измеряли при интенсивности ФАР 190 мкмоль/(м2 с). Кривую зависимости Фв от освещенности получали, экспонируя лист сначала при минимальной ФАР, затем интенсивность ФАР ступенчато повышали до максимального уровня — 1000 мкмоль/(м2 с). В конце эксперимента камеру затемняли, и измеряли Дт. Методика определения ключевых параметров световой кривой была подробно описана нами ранее [15]. Все определения фотосинтеза и дыхания проводили в 6-8-кратной биологической по-вторности.
Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла определяли с помощью портативного флуориметра РАМ-2100 ("Walz", Германия), руководствуясь инструкцией производителя ("Heinz Walz GmbH", 2003). Сначала измеряли
величину стационарного (Ft), фонового (F0) и
максимального (F^) уровня флуоресценции хлорофилла листа, адаптированного к действующему свету (190 мкмоль/(м2 с)). После 30 мин темно-вой адаптации листьев регистрировали фоновый (F0) и максимальный (Fm) уровни флуоресценции. F0 измеряли на слабом красном свету с частотой модуляций 600 Гц, не вызывающих фотохимической реакции; Fm измеряли после короткого импульса (0.8 с) насыщающего света 4000 мкмоль /(м2 с). Максимальный квантовый выход фотохимической активности ФС II (Fv/Fm) рассчитывали как (Fm — Fc)/Fm. Величину фотохимического (qP) и нефотохимического (qN) тушения флуоресценции хлорофилла находили как (F^ — Ft)/ (F'm — F0) и
(Fm — F^) /(Fm — F0) соответственно. Показатели индуцированной флуоресценции хлорофилла измеряли в 8-12-кратной биологической повторности.
Концентрацию хлорофиллов в листовых пластинках определяли спектрофотометрически в ацетоновых вытяжках при длинах волн 662 и 644 (хлорофиллы а и b) в 5-кратной биологической повторности.
Интенсивность дыхания измеряли по скорости поглощения О2 при 21 °С полярографически с использованием электрода Кла
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.