ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2014, том 61, № 3, с. 350-358
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.19:517.152.1
АКТИВНОСТЬ И ИЗОФЕРМЕНТНЫЙ СОСТАВ ПЕРОКСИДАЗЫ ВАКУОЛЕЙ КЛЕТОК КОРНЕПЛОДОВ СТОЛОВОЙ СВЕКЛЫ НА РАЗНЫХ ФАЗАХ ОНТОГЕНЕЗА И ПРИ ИЗМЕНЕНИИ УСЛОВИЙ ХРАНЕНИЯ © 2014 г. О. Д. Нимаева, Е. В. Прадедова, Р. К. Саляев
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Сибирский институт физиологии и биохимии растений
Сибирского отделения РАН, Иркутск Поступила в редакцию 01.04.2013 г.
На разных фазах развития корнеплодов столовой свеклы (Beta vulgaris L.) исследовали активность и изоферментный состав фенолзависимой пероксидазы (ПО) вакуолей. Установили, что ферментативная активность повышалась во время роста и снижалась в период покоя корнеплодов. Изоферментный состав ПО тоже изменялся, дополнительные катионные и анионные изоформы были выявлены в период роста и на определенных этапах покоя. Зачастую в период покоя корнеплоды подвергаются таким видам стресса, как водный дефицит и патогенез. В связи с этим провели исследование активности фермента у корнеплодов с выраженными признаками увядания и инфицирования патогенными микроорганизмами. Активация ПО была отмечена у инфицированных корнеплодов, а увеличение числа катионных изоформ — у корнеплодов, испытывающих водный стресс. В зависимости от фазы развития и воздействия стрессора изменялись оптимумы pH для фермента: в период покоя и при водном стрессе они смещались в сторону низких значений. Сдвиг оп-тимумов рН происходил одновременно с появлением индуцибельных катионных изоформ. При исследовании pH-зависимости катионных ПО, которые были ассоциированы главным образом с то-нопластом, обнаружили, что оптимальными для них были pH 4.0 и 5.0. Наблюдаемые изменения уровня активности и изоферментного состава предполагают активное участие ПО вакуолярной локализации в метаболических процессах и защитных реакциях клеток корнеплодов.
Ключевые слова: Beta vulgaris — вакуоль — пероксидаза — стресс — онтогенез
DOI: 10.7868/S0015330314030105
ВВЕДЕНИЕ
В клетках растений при окислительном стрессе индуцируется фенолзависимая пероксидаза (ПО, КФ 1.11.1.7) [1, 2]. Как фермент защитных реакций, ПО привлекает особое внимание благодаря не только высокому сродству к пероксиду водорода, но и способности генерировать активные формы кислорода (АФК). Наибольшая активность и разнообразие изоформ ПО характерны для вакуолей и клеточных стенок [3]. Основные функции ПО этих компартментов клетки, согласно современным представлениям, различны. Если фермент клеточных стенок вовлечен в лигнификацию и суберинизацию, регуляцию клеточного растяжения, катаболизм ауксина, генерацию АФК и защиту от патогенных микроор-
Сокращения: ГВ — гваякол; ДАБ — 3,3'-диаминобензидин-4НС1; ИЭФ — метод изоэлектрофокусирования белков; ПО — фенолзависимая пероксидаза.
Адрес для корреспонденции: Прадедова Елена Владимировна. 664033 Иркутск, а/я 317. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: (3952) 51-07-54; электронная почта: praded@sifibr.irk.ru
ганизмов, то ПО вакуолей, как полагают, активно окисляет бетацианины и другие фенольные соединения [3-6], участвуя таким образом в утилизации избыточного Н202 и модификации функциональной активности фенольных соединений. Благодаря этому свойству вакуолярных перокси-даз, все чаще высказывают предположение об ощутимом вкладе вакуоли в поддержание редокс-гомеостаза цитоплазмы и в целом о ведущей роли в формировании защитного ответа клетки при окислительном стрессе [2, 6]. Несмотря на то, что это предположение не вызывает сомнений, в действительности фактов, подтверждающих причастность именно вакуолярных ПО, а не общеклеточных пе-роксидаз или ПО клеточных стенок, к формированию защитных реакций клетки при действии стресс-факторов, явно недостаточно [6].
Ранее мы установили, что в вакуолях корнеплодов столовой свеклы присутствует ПО, которая эффективно функционирует при низких значениях рН и имеет высокое сродство к бензиди-нам [7]. Фермент представлен широким спектром
анионных и основных изоформ, специализация и роль которых не установлены.
Когда пытаются выяснить роль или функцию фермента защитной антиоксидантной системы, как правило, моделируют условия, при которых происходит окислительный взрыв в клетках растений, и по уровню активности фермента судят о его вкладе в защитные реакции клеток. Подобные эксперименты значительно упрощаются с таким объектом исследования, как корнеплод столовой свеклы, который в онтогенезе растения проходит ряд ключевых этапов развития. Формирование и рост корнеплода происходят в летнее время в период высоких температур и влажности (первый год вегетации). Зимой же он переживает стадию покоя, которая протекает при пониженных температурах и влажности, т.е. корнеплод длительное время подвергается воздействию стресс-факторов. Следует отметить, что на фоне низкотемпературного и водного стрессов в период покоя корнеплод особенно восприимчив к действию патогенных микроорганизмов. Все перечисленные виды стресса, согласно современным представлениям, сопровождаются усилением окислительных процессов и активацией систем антиокси-дантной защиты [2]. При длительном воздействии неблагоприятных факторов может развиться окислительный стресс, приводящий к ослаблению защитных механизмов. Вероятность его развития у покоящихся корнеплодов свеклы особенно высока при нарушении условий хранения. Учитывая указанные обстоятельства, мы поставили перед собой цель исследовать уровень активности и изоферментный состав ПО у корнеплодов столовой свеклы на разных стадиях их развития, а также у корнеплодов с выраженными признаками увядания (при водном стрессе) и инфицирования патогенными микроорганизмами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальный материал. Растения столовой свеклы (Beta vulgaris L.) сорта Бордо-237 выращивали на опытном участке института. В зимний период корнеплоды хранили при температуре 4°C.
Для экспериментов отбирали корнеплоды на следующих фазах развития: во время роста в первый год вегетации растения (август) и во время покоя (сентябрь—июнь). Фазу покоя условно поделили на три стадии: (а) стадия начала покоя — первые недели после уборки и укладки корнеплодов на хранение (сентябрь); (б) глубокого покоя (декабрь—март); (в) выхода из покоя, когда у корнеплода начинали формироваться новые боковые корни и возобновлялись ростовые процессы (май—июнь).
Исследовали влияние таких стресс-факторов, как водный дефицит и инфицирование микроорганизмами.
При водном дефиците у растений в связи с обезвоживанием их тканей развивается гиперосмотический стресс. Когда корнеплоды свеклы выдерживали при комнатной температуре на открытом воздухе в течение пяти суток, то наблюдали заметное увядание, вызванное обезвоживанием тканей. Для проведения серии таких опытов отбирали корнеплоды (по десять на каждый вариант) в первые недели после уборки. В начале эксперимента и по окончании пяти дней (после увядания) корнеплоды взвешивали. Из корнеплодов, до увядания и после, получали сок. Для этого их ткани растирали, отжимали, и затем полученный экстракт центрифугировали 10 мин при 12000 g. Определяли рН и осмотичность сока; измерения проводили на рН-метре 766 Calimatic ("Knick", Германия) и осмометре ОМКА 1Ц-01 (Россия).
При неблагоприятных условиях выращивания и нарушении условий хранения у корнеплодов свеклы развивается заболевание, называемое ка-гатная гниль, которое вызывается комплексом грибных и бактериальных патогенов [8]. Для проведения эксперимента брали инфицированные естественным путем корнеплоды свеклы, имеющие характерные для этого комплексного заболевания симптомы: вдавленные пятна — признаки ризоктониоза (возбудитель Rhizoctonia solani Kue-hn, syn. Rh. aderholdii Kolosch.); бурые пятна и серый налет — признаки серой гнили (возбудитель Botrytis cinerea Pers. ex Fr.); бурые некротические образования во внутренних тканях — признаки фомоза (возбудитель Phoma betae Frank.) и бактериального инфицирования [8]. На стадии глубокого покоя зараженные корнеплоды укладывали в камеру вместе с корнеплодами опытных вариантов и для ускорения процесса естественного заражения и развития заболевания меняли условия хранения: на 30 дней повышали температуру до 8-10°С; затем возобновляли прежний температурный режим (4°С). Корнеплоды контрольных вариантов хранили при тех же температурных условиях. По окончании эксперимента, в фазе выхода из покоя корнеплоды опытного варианта имели выраженные признаки заболевания в виде некрозов разной локализации. У корнеплодов контрольного варианта видимых признаков заболевания не наблюдали. У некротизированных корнеплодов вырезали участки неповрежденных тканей, из которых впоследствии выделяли вакуоли или получали тканевой экстракт.
Выделение вакуолей из тканей корнеплода проводили модифицированным макрообъемным методом [9]. Фракцию изолированных вакуолей дополнительно очищали от примесей органелл
(пластид, ядер) и клеточных стенок в ступенчатом градиенте плотности сахарозы—KCl (1.050 ^ ^ 1.080 ^ 1.145 ^ 1.180 г/см3) [9]. Во время центрифугирования такого градиента (10 мин при 125 g) формируются две фракции органелл, условно определенные как "легкие" и "тяжелые" вакуоли [9]. "Легкие" вакуоли (с меньшей плавучей плотностью) располагались на границе растворов с плотностью 1.050 и 1.080 г/см3, а "тяжелые" (с большей плавучей плотностью) — на границе растворов с плотностью 1.080 и 1.145 г/см3. В настоящей работе исследование проводили с фракцией "тяжелых" вакуолей. Органеллы этой фракции отличаются высокой стабильностью (время полураспада 8 ч) и наибольшим изоферментным разнообразием ПО [7].
Чистоту вакуолярных фракций контролировали с помощью светового микроскопа ("Carl Zeiss", Германия), а также биохимическими методами. В частности, определяли присутствие ДНК (маркер загрязнения ядрами, пластидами и митохондриями) [10], а также активность таких маркерных ферментов, как цитохром с оксидаза, НАДФ-малатдегидрогеназа и каталаза. ДНК и активность перечисленных ферментов в вакуоляр-ных экстрактах не выявлены.
Вакуолярное содержимое извлекали, разрушая
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.