научная статья по теме АКТИВНОСТЬ ИНВЕРТАЗЫ В ТКАНЯХ СТВОЛА КАРЕЛЬСКОЙ БЕРЕЗЫ Биология

Текст научной статьи на тему «АКТИВНОСТЬ ИНВЕРТАЗЫ В ТКАНЯХ СТВОЛА КАРЕЛЬСКОЙ БЕРЕЗЫ»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2015, том 62, № 6, с. 804-813

^=ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

УДК 581.1

АКТИВНОСТЬ ИНВЕРТАЗЫ В ТКАНЯХ СТВОЛА КАРЕЛЬСКОЙ БЕРЕЗЫ © 2015 г. Н. А. Галибина*, Л. Л. Новицкая*, М. С. Красавина**, Ю. Л. Мощенская*

*Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт леса Карельского научного центра РАН, Петрозаводск

**Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Поступила в редакцию 05.03.2015 г.

Исследовали две формы Betulapendula Roth: обычную березу повислую (B. pendula var. pendula) и карельскую березу (B. pendula var. carelica), различающиеся по текстуре древесины. Определение активности разных форм инвертазы в тканях ствола березы повислой выполнено впервые. В период активного функционирования камбия во флоэме и ксилеме обеих форм березы присутствовали все три формы инвертазы: вакуолярная, цитоплазматическая и апопластная. Отличительной особенностью флоэмы и ксилемы карельской березы являлась высокая активность апопластной инвертазы. Высказано предположение о том, что изменение программы дифференцировки клеток камбиальной зоны карельской березы, ведущее к повышению степени паренхиматизации проводящих тканей, связано с интенсивным гидролизом сахарозы в апопласте. Полученные данные подтверждают появившееся в литературе мнение о возможном участии инвертазы в синтезе компонентов клеточных стенок.

Ключевые слова: Betula pendula var. carelica — вакуолярная, цитоплазматическая, апопластная инвертазы — сахароза — фруктоза — глюкоза

DOI: 10.7868/S0015330315060068

ВВЕДЕНИЕ

Карельская береза (Betula pendula Roth var. carelica) — форма березы повислой (B. pendula var. pendula), у которой в зонах структурных аномалий ствола значительно повышена степень паренхиматизации проводящих тканей. В ходе камбиального роста в этой области происходит изменение программы клеточной дифференцировки: вместо ситовидных трубок флоэмы и сосудов и волокнистых трахеид ксилемы формируются клетки паренхимы [1]. Включения паренхимы придают древесине карельской березы характерный узор.

Деятельность камбия у березы повислой осуществляется за счет притока сахарозы из фото-синтезирующих листьев [1]. Наши исследования показали, что у березы повислой с обычным строением тканей ствола ростовые процессы сосредоточены главным образом в ксилеме, и ее ат-трагирующая сила создается за счет высокой активности сахарозосинтазы (СС) [2] — фермента,

Сокращения: АпИнв — апопластная инвертаза; ВакИнв — вакуолярная инвертаза; ЦитИнв — цитоплазматическая инвертаза; СС — сахарозосинтаза; ТФЭ — твердофазная экстракция.

Адрес для корреспонденции: Галибина Наталия Алексеевна. 185910 Петрозаводск, ул. Пушкинская, 11. Институт леса КарНЦ РАН. Электронная почта: galibina@krc.karelia.ru

расщепляющего сахарозу на УДФ-глюкозу и фруктозу. Это согласуется с широко распространенным мнением о роли СС в формировании клеточных оболочек, а именно, что форма СС, связанная с плазмалеммой, входит в состав цел-люлозосинтазного комплекса и поставляет УДФ-глюкозу для синтеза целлюлозы ([3—5] и др.).

У карельской березы активность СС в ксилеме в период деятельности камбия в 2.6 раза ниже по сравнению с обычной березой повислой [2], тем не менее, синтез компонентов клеточных стенок идет достаточно интенсивно, поскольку формирование паренхимы связано с делением веретено-видных клеток камбиальной зоны с помощью большого числа поперечных перегородок [1]. В работе Gerber с соавт. [6] на трансгенных линиях осины с сильно пониженной активностью СС показано, что этот фермент не является специфичным для реакций биосинтеза целлюлозы, но играет важную роль в распределении общего углерода среди полимерных компонентов клеточных стенок. Возможность синтеза клеточных оболочек при подавлении экспрессии генов СС была продемонстрирована и на трансгенных растениях арабидопсиса [7]. В последнем случае предположили, что пополнение пула УДФ-глюкозы в

клетках шло с участием гексоз, образующихся при гидролизе сахарозы с помощью инвертазы.

Инвертаза (КФ 3.2.1.26) — это гидролаза, которая расщепляет молекулу сахарозы на две гексозы — глюкозу и фруктозу. В растении обнаружено три формы инвертазы, отличающиеся по своим биохимическим свойствам и месту локализации, — вакуолярная (ВакИнв), цитоплазмати-ческая (ЦитИнв) и апопластная (АпИнв). Показано, во-первых, что формы инвертазы наряду с СС участвуют в создании концентрационного градиента сахарозы в месте разгрузки флоэмы, но основная роль в регуляции ее транспорта у большого числа растений с апопластной разгрузкой принадлежит АпИнв или инвертазе клеточной стенки и, во-вторых, что соотношение активностей разных форм инвертазы определяет преимущественное включение расщепляемой ими сахарозы в те или иные метаболические пути и как следствие оказывает влияние на направление дифференциации производных камбия [7—15]. Следует отметить, что эти работы выполнены главным образом на травянистых растениях. По древесным растениям публикации немногочисленны и стали появляться лишь в последние десять лет [10, 16—18].

Принимая во внимание пониженную активность СС в ксилеме карельской березы [2], мы предположили, что важная роль в метаболизации сахарозы при формировании проводящих тканей этого древесного растения может принадлежать тем или иным формам инвертазы. В настоящей статье представлены данные, характеризующие активности апопластной, вакуолярной и цито-плазматической инвертаз и содержание растворимых сахаров (сахарозы, глюкозы, фруктозы) в тканях ствола двух форм березы, различающихся по текстуре древесины, — обычной березы повислой и карельской березы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Растительный материал и отбор образцов. Как и

в предыдущей работе [2], использовали две формы 40-летних деревьев Betula pendula: обычную березу повислую (Betula pendula Roth var. pendula, далее в тексте — обычная береза) и карельскую березу (B. pendula var. carelica). Деревья обычной березы повислой имели типичную для вида прямослойную древесину со слабо выраженной текстурой. Среди деревьев карельской березы подбирали экземпляры с высокой степенью узорчатости древесины ствола. Все опытные растения произрастали в одинаковых почвенно-климати-ческих условиях на Агробиологической станции Карельского научного центра РАН в 2 км от Петрозаводска (61°45' с.ш., 34°20' в.д.). Ткани для анализа отбирали в области нижней трети ствола, поскольку именно здесь у "узорчатых" растений

карельской березы аномальность строения тканей выражена наиболее ярко.

У березы повислой в условиях Карелии активное функционирование камбия наблюдается, начиная со второй декады июня и до конца июля [1]. В это время основная масса ассимилятов тратится на новообразование клеток камбиальной зоны и рост клеточной стенки. Образцы собирали в июне (21.06) и июле (19.07) 2010 г. В год отбора образцов в связи с отсутствием дождей и высокими температурами в июле наблюдалось преждевременное торможение деятельности камбия [2].

На стволе березы вырезали окошки 20 х 8 см и отделяли кору от древесины. С обнаженной поверхности древесины лезвием бритвы соскабливали ткани ксилемы, включающие материнские клетки ксилемы и наружные слои прироста ксилемы текущего года. С внутренней поверхности коры отделяли ткани, включающие камбиальную зону, проводящую флоэму и самые внутренние слои непроводящей флоэмы. В дальнейшем эти ткани обозначены как "флоэма". Все образцы просматривали под световым микроскопом. Ткани для анализа брали с пяти растений каждой формы березы.

Микроскопические исследования. После отделения коры от древесины с внутренней поверхности коры и обнаженной поверхности древесины вырезали кубики тканей объемом 3 мм3. Фиксацию тканей проводили в 70% спирте. С помощью замораживающего микротома Frigomobil ("Reichert-Jung", Австрия) изготавливали поперечные срезы ксилемы и флоэмы толщиной 15 мкм. Срезы исследовали под микроскопом Axio Imager A1 ("Carl Zeiss", Германия). В ксилеме и флоэме подсчитывали число рядов структурных элементов, сформированных в текущем году и имеющих явные признаки дифференцировки. В ксилеме выделяли зоны, лишенные сосудов, и подсчитывали число рядов волокнистых трахеид с признаками вторичного утолщения оболочек, во флоэме — число рядов ситовидных трубок. Остановку деятельности камбия в июле определяли по сокращению ширины камбиальной зоны и появлению сплющенных в радиальном направлении клеток ксилемы, создающих контуры ложного годичного кольца.

Срезы ксилемы окрашивали 1% водным раствором сафранина, что позволило выявлять клеточные оболочки, начиная с ранних этапов лиг-нификации. Анализ срезов проводили в проходящем свете микроскопа.

При изучении слоев проводящей флоэмы использовали метод выявления каллозы на порах ситовидных трубок. Срезы окрашивали 0.005% раствором анилинового голубого в 0.1 М фосфатном буфере, рН 8.0, и исследовали под микроскопом в проходящем свете и в режиме люминесцен-

ции. Светящиеся отложения каллозы имели ярко-голубую окраску.

Биохимические исследования. Ткани растирали в жидком азоте до однородной массы и гомогенизировали при 4°C в буфере в течение 20 мин. Состав буфера: 50 мМ Hepes-буфер (pH 7.5), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 3 мМ ДТТ, 5 мМ MgCl2, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF). Полученный гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин (центрифуга 2-16PK, "Sigma", Германия), осадок троекратно промывали буфером, супернатант объединяли и диализо-вали при 4°C в течение 18—20 ч против буфера для гомогенизации, разбавленного в 10 раз.

В полученных после диализа ферментативных препаратах свободные гексозы и сахароза не определялись. В осадке определяли апопластную ин-вертазу, связанную с клеточной стенкой (АпИнв), в супернатанте — вакуолярную (ВакИнв) и цито-плазматическую (ЦитИнв) инвертазы. Активности ферментов определяли после инкубации полученного препарата при 30°C в течение 30 мин. Инкубационная среда для определения активности инвертазы содержала 100 мМ ацетатный буфер (рН 4.7) (АпИнв и ВакИнв) или 50 мМ Hepes-бу-фер (рН 7.5) (ЦитИнв), концентрация сахарозы — 25 мМ. Ко

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком