НЕИРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 3, с. 222-226
_ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ _
РАБОТЫ
УДК 577.15
АКТИВНОСТЬ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В МЕДИАЛЬНОЙ ПРЕОПТИЧЕСКОЙ ОБЛАСТИ И СРЕДИННОМ ВОЗВЫШЕНИИ САМОК КРЫС РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ ГРУПП
© 2008 г. А. В. Разыграев, А. В. Арутюнян*, М. Г. Степанов, Ю. П. Милютина, Т. А. Мазур
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург
Изучена общая моноаминоксидазная активность в медиальной преоптической области и срединном возвышении (с окружающей тканью) самок крыс в трех возрастных группах: 1.5-2 мес. (перипубер-татный период), 4-5 мес. (период половой зрелости), более 12 мес. (период старения). Активность моноаминоксидазы определяли, используя кинурамин в качестве субстрата и регистрируя прирост концентрации продукта (4-гидроксихинолина) при 327 нм. В ткани медиальной преоптической области наименьшая активность (нмоль кинурамина/мин/мг белка, M ± m) выявлена в перипубертат-ный период (1.55 ± 0.11), у молодых половозрелых и стареющих крыс найдены сходные значения активности (1.93 ± 0.12 и 2.01 ± 0.15, соответственно). В срединном возвышении наибольшие значения активности моноаминоксидазы выявлены в группе стареющих крыс (6.61 ± 0.56), для групп пе-рипубертатного возраста и периода половой зрелости характерны сходные значения (4.79 ± 0.57 и 4.36 ± 0.25, соответственно). У животных возраста 4-5 мес. выявлена тенденция к отрицательной корреляции между активностями моноаминоксидазы в медиальной преоптической области и срединном возвышении с окружающей тканью. Предполагается наличие противоположно направленных изменений активности фермента для обеспечения согласованной работы моноаминэргических систем в исследованных областях.
Ключевые слова: моноаминоксидаза, мозг, преоптическая область, срединное возвышение, онтогенез.
Моноаминоксидазы (МАО) - группа ферментов, участвующих в метаболизме ряда соединений аминной структуры. Известно, что биогенные амины, окисляемые посредством МАО, вовлечены в контроль многих функций организма на уровне головного мозга, в частности, над синтезом и секрецией гонадолиберина - гипоталами-ческого регулятора функции размножения у позвоночных [1]. За последние несколько десятилетий было собрано достаточно большое количество данных, подтверждающих вовлеченность МАО в гипоталамические механизмы регуляции репродуктивной функции млекопитающих [2-7].
Однако данные, полученные в экспериментах по использованию ингибиторов МАО, несколько противоречивы. По данным ряда авторов, обработка животных (крысы, хомяки) изокарбоксази-дом, транилципромином и ипрониазидом приводит к блоку овуляции [2, 5, 7]. Использование пар-гилина вызывает отмену преовуляторного пика лютеинизирующего гормона (ЛГ) у крыс наряду с повышением содержания серотонина, норадрена-
* Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3; тел. (812) 328-98-91; факс: (812) 328-23-61; e-mail: arutjunyan@aa3703.spb.edu
лина и дофамина в медиальной преоптической области (МПО) (сайте преимущественной локализации перикарионов гонадолиберинэргических нейронов, проецирующихся главным образом в срединное возвышение (СВ)). При этом снижение содержания серотонина в МПО, вызванное микроинъекциями 5,7-дигидрокситриптамина, ведет к усилению секреции ЛГ у овариэктомированных крыс, обработанных эстрадиолом и прогестероном [4]. Это говорит о необходимости наличия относительно высокого уровня активности МАО для осуществления овуляции, приводящего к низкому содержанию биогенных аминов в МПО. Согласно другим сведениям, депренил вызывает частичное восстановление репродуктивной цикличности у стареющих животных, действуя при этом не только на метаболизм дофамина, но и на уровни серотонина в медиальном базальном гипоталамусе, откуда происходит секреция гонадолиберина в кровь [6]. Такие сведения, напротив, указывают на важность снижения уровня активности МАО для реализации эстрального цикла.
В то же время, помещение самок крыс в условия постоянной темноты или постоянной освещенности, при которых нарушается и исчезает циклический характер функционирования репро-
дуктивной системы, сопровождается снижением активности МАО А и МАО В гипоталамуса [3], что подтверждает представление о необходимости высокого уровня активности данных ферментов в гипоталамических структурах для реализации репродуктивной цикличности, не согласуясь при этом с данными, полученными при использовании депренила [6].
Дополнительную информацию, позволяющую судить о роли МАО в механизмах гипоталамиче-ской регуляции репродуктивной функции, дает исследование моноаминоксидазной активности в структурах гипоталамуса, в которых происходит синтез (МПО) и секреция (СВ) гонадолиберина. Задачей данной работы являлось изучение уровней активности МАО в МПО и СВ в такие периоды онтогенеза, как период становления, нормального состояния и угасания репродуктивной функции, а также исследование корреляционной связи между активностью МАО в МПО и СВ самок крыс внутри разных возрастных групп.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент был выполнен на крысах-самках линии Вистар, полученных из питомника "Раппо-лово" РАМН. Крыс предварительно держали в виварии не менее 13 сут при световом режиме 12 ч света: 12 ч темноты и с получением стандартного корма и воды.
Для эксперимента использовались крысы трех возрастных групп. Первую группу составили самки в возрасте 1.5-2 мес. (массой 84.0 ± 22.1 г (М ± ± ББ)). Данный возраст представляет перипубер-татный период онтогенеза самок крыс. Указанный период охватывает время открытия влагалища и формирования эстральных циклов [8]. Вторая группа - 4-5-месячные половозрелые крысы (средний возраст, характеризующийся оптимальным функционированием репродуктивной системы) (масса 241.8 ± 12.5 г (М ± ББ)). В третью группу входили животные в возрасте более 12 мес. (стареющие крысы) (масса 311.5 ± 18.3 г (М ± ± ББ)). Старение у крыс начинается с 7 по 10-й месяцы жизни и в возрасте более 12 мес. охватывает механизмы гипоталамо-гипофизарного контроля репродуктивной функции, выражаясь в изменении продукции гонадолиберина, снижении уровня стероид-индуцированного выброса лютеинизиру-ющего гормона и других явлениях, сопровождающих переход в состояние ацикличности [9, 10].
Все животные были декапитированы в один день в период с 5 ч до 11 ч дневной фазы экспериментальных суток с чередованием крыс из разных возрастных групп. Головной мозг извлекали, охлаждали до 0°С, после чего подвергали замораживанию при -65°С.
Выделение и предварительная обработка микроструктур. Из головного мозга лезвием выделяли участок преоптической области тетра-эдрической формы, вентральная поверхность которого примыкает к дорсальной стороне оптической хиазмы. Срединное возвышение с окружающей тканью выделяли в виде участка ткани четырехугольно-пирамидальной формы, основание которого содержало собственно срединное возвышение. Ткань гомогенизировали в 20 мкл 0.25 М раствора сахарозы в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.8. Для проведения ферментативной реакции использовали супернатант, полученный в результате двукратного центрифугирования го-могенатов при 1000 § в течение 10 мин. Все анатомические структуры одного и того же вида (МПО или СВ с окружающей тканью) подвергались каждому из отдельных этапов обработки в один и тот же день.
Определение моноаминоксидазной активности. Ферментативную активность определяли с использованием метода, описанного в работах [11, 12] с незначительными модификациями. Реакционная смесь состояла из раствора кинурами-на (конечная концентрация - 0.21 мМ) в 0.05 М фосфатном буфере (рН 7.8) и биологического материала. К 750 мкл раствора кинурамина добавляли 8-10 мкл супернатанта гомогената ткани (конечная концентрация белка 15-70 мкг/мл реакционной смеси). Инкубацию проводили при 37°С в отдельных спектрофотометрических кюветах для каждой пробы (объем 1 мл, длина оптического пути 1 см), периодически измеряя оптическую плотность при 327 нм, тщательно перемешивая содержимое кюветы перед измерением. Периодические измерения позволяли убедиться в постоянстве прироста концентрации продукта реакции (4-гидроксихинолина). В качестве стандарта использовали раствор кинурамина, измеряя его концентрацию по величине оптической плотности при 360 нм, удельную активность выражали в нмолях окисленного кинурамина/мин/мг белка. Для этого использовали известное соотношение между приростом оптической плотности при 327 нм и одновременной убылью при 360 нм, происходящими вследствие увеличения концентрации 4-гидроксихинолина и сопряженной с ним убыли концентрации кинурамина [11].
Содержание белка определяли в каждой реакционной среде после окончания инкубации по методу с использованием трихлоруксусной кислоты, описанному в работе [13], регистрируя оптическую плотность при 500 нм вместо 340 нм во избежание влияния присутствия кинурамина при более коротких длинах волн.
Исследование ферментативной активности в пробах одного вида (МПО или СВ с окружающей
активность МАО в МПО, нмоль/мин/мг белка 2.5
2.0 1.5 1.0 0.5 0
1,5 - 2 месяца (10) >12 месяцев (10)
4 - 5 месяцев (11)
активность МАО в СВ, нмоль/мин/мг белка 8.0
7.0
6.0
5.0
4.0
3.0
2.0
1.0
0
- * т 1
1 т
_
- 1 1
1,5 - 2 месяца (9) >12 месяцев (10)
4 - 5 месяцев (11)
Рис. 1. Активность моноаминоксидазы (МАО) в ткани медиальной преоптической области (МПО) в трех возрастных группах самок крыс (М ± т). В скобках указано количество особей (и).
* различия достоверны (р < 0.05) при сравнении с 1.5-2-месячными животными.
Рис. 2. Активность моноаминоксидазы (МАО) в срединном возвышении (СВ) (с окружающей тканью) в трех возрастных группах самок крыс (М ± т). В скобках указано количество особей (и). * различия достоверны (р < 0.05) при сравнении с животными возраста более 12 месяцев. ** различия достоверны (р < 0.01) при сравнении с 4-5-месячными животными.
1,5 - 2 месяца
4 - 5 месяцев
>12 месяцев
МАО в МПО 2.5
2.0 1.5 1.0 0.5
0
♦ ♦
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
10 0
3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5
60
10 15 МАО в СВ
Рис. 3. Корреляционные связи между активностями моноаминоксидазы (МАО
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.