НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 3, с. 206-210
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.15
АКТИВНОСТЬ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС
© 2007 г. А. В. Разыграев, А. В. Арутшнян*
НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург
С использованием спектрофотометрического метода, основанного на реакции окисления кинура-мина и регистрации образования продукта реакции при 327 нм, исследовано распределение общей моноаминоксидазной активности среди нескольких областей гипоталамуса, лимбической системы, в дорсальном ядре шва, locus coeruleus с окружающей тканью, а также в гипофизе самок крыс. Наибольшая активность (нмоль кинурамина/мин/мг белка, M± m) выявлена в срединном возвышении с окружающей тканью (8.03 ± 0.28), наименьшая - в ткани гипофиза (0.61 ± 0.05). Промежуточные значения выявлены для дорсального ядра шва (3.10 ± 0.12), медиальной преоптической области (2.61 ± 0.36), locus coeruleus с окружающей тканью (2.20 ± 0.22), маммилярного тела (2.00 ± 0.19), коры обонятельных бугорков (1.43 ± 0.05) и миндалин (1.41 ± 0.32). В срединном возвышении с окружающей тканью, дорсальном ядре шва, медиальной преоптической области и locus coeruleus с окружающей тканью изучены уровни активности изоферментов моноаминоксидазы типов А и В. Для данных четырех структур выявлены сходные значения активности МАО типа А; активность МАО типа В снижается в порядке перечисления структур. Из этого следует, что выявленные достоверные различия в общей моноаминоксидазной активности среди данных областей определяются в первую очередь уровнями активности МАО типа В.
Ключевые слова: моноаминоксидаза, мозг, распределение.
В настоящее время флавинзависимая моноаминоксидаза (МАО) млекопитающих считается хорошо изученным ферментом. Уже достаточно давно получено немало данных о внутриорганном распределении активности данного фермента, в частности в головном мозгу крыс. Активность МАО изучена с использованием различных субстратов, в числе которых соединения, позволяющие выявлять не только общую активность ами-ноксидаз, но и отдельных изоферментов (МАО типов А и В). Также описано внутримозговое распределение активности изоферментов при использовании специфических ингибиторов [1-17].
Однако в некоторых работах показаны различия в клеточном и субклеточном распределении активностей МАО в отношении определенных субстратов, причем различия могут касаться активностей, принадлежащих к одному типу изоферментов. Так, в гомогенатах мозга крыс обнаружены синаптосомы, в которых заключены митохондрии, обогащенные норадреналиндезаминазной активностью и отличающиеся как от синаптосо-мальных митохондрий, дезаминирующих преимущественно серотонин и дофамин, так и от свободных (происходящих из перинуклеарных зон нейронов и из глиальных клеток) митохондрий,
* Адресат для корреспонденции: 199034 Санкт-Петербург, Менделеевская линия, 3; тел.: (812) 328-98-91; факс: (812) 328-23-61: e-mail: arutjunyan@aa3703.spb.edu.
характеризующихся высоким сродством к кину-рамину [2, 10, 18]. Это позволяет предполагать, что активность МАО в отношении как общих субстратов для МАО типов А и В, так и специфических субстратов может быть различным образом распределена в головном мозгу. В связи с этим представляют интерес исследования с применением разнообразных субстратов МАО, что расширяет представления о распределении и спектре физиологических функций МАО головного мозга. В настоящем исследовании представлена картина распределения кинураминоксидаз-ной активности среди некоторых анатомических областей головного мозга крыс.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на половозрелых самках крыс (вес 273.1 ± 26.7 (М ± SD)) линии Вистар из питомника "Рапполово" РАМН. Животные содержались в виварии со световым режимом 12 ч света: 12 ч темноты и получали стандартный корм и воду. Декапитацию крыс проводили в период с 5 ч от начала экспериментальной дневной фазы до ее окончания. Головной мозг и гипофиз извлекали и подвергали замораживанию при - 65°С.
Выделение и предварительная обработка анатомических структур. Топографическая идентификация анатомических образований осу-
Рис. 1. Топография областей головного мозга, использовавшихся для изучения активности МАО (схема, вид с вентральной стороны). A - миндалины, C -locus coeruleus с окружающей тканью, E - срединное возвышение с окружающей тканью, М - маммиляр-ное тело, P - медиальная преоптическая область, R -дорсальное ядро шва, T - обонятельный бугорок (то же для таблицы 1 и рис. 2, 3).
г1~~1
ш.
E(32) R(12) P(31) C(6) M(10) T(22) A(9) H(9)
Рис. 2. Распределение общей моноаминоксидазной активности (нмоль окисленного кинурамина/мин/мг белка) среди исследованных структур (М ± т). Н - гипофиз (то же для таблицы 1). В скобках указано количество особей (п).
ществлялась с использованием атласов анатомии головного мозга крыс [12, 14]. Из головного мозга выделяли следующие области (рис.1): ряд гипо-таламических образований (срединное возвышение с окружающей тканью, медиальная преоптическая область и маммилярное тело), корковый участок обонятельных бугорков, миндалины, дорсальное ядро шва и locus coeruleus с окружающей тканью. Ткань гомогенизировали в 0.25 М растворе сахарозы в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.8. Для проведения ферментативной реакции использовали супернатант, полученный в результате центрифугирования гомогенатов при 1000 g в течение 10 мин.
Определение активности МАО. Для определения моноаминоксидазной активности был использован метод, описанный в работе [3]. Реакционная среда представляла собой раствор кинура-мина в 0.05 М фосфатном буфере, рН 7.8. Конечная концентрация кинурамина - 0.19 мМ. К 730-750 мкл раствора кинурамина (0.192-0.198 мМ) добавляли супернатант гомогената ткани до объема 760 мкл (конечная концентрация белка 20200 мкг/мл). Инкубацию проводили при 37°С в отдельных кюветах (объем 1 мл, длина оптического пути 1 см) для каждой пробы, периодически (с получасовым интервалом) измеряя оптическую плотность при длине волны 327 нм. Непосредственно перед измерением оптической плотности пробы тщательно перемешивали. При используемой длине волны регистрируется прирост в концентрации 4-гидроксихинолина, образующегося в результате спонтанной внутримолекулярной циклизации промежуточного продукта окислительного дезаминирования кинурамина. Периодические измерения оптической плотности позволяли убедиться в постоянстве скорости образования 4-гидроксихинолина. В случае образцов срединного
возвышения, медиальной преоптической области, дорсального ядра шва и locus coeruleus также исследовали вклад изоферментов в общую активность МАО, для чего использовали R-депренил в концентрации, ингибирующей специфическую активность МАО типа В (0.002 мМ) [7].
Содержание белка определяли в каждой реакционной среде после окончания инкубации по методу с использованием трихлоруксусной кислоты, описанному в работе [15], регистрируя оптическую плотность при 500 нм.
Удельную активность фермента выражали в нмолях окисленного кинурамина/мин/мг белка, для чего использовали соотношение между приростом оптической плотности при 327 нм и одновременной убылью при 360 нм (AOD327/AOD360), происходящими вследствие увеличения концентрации 4-гидроксихинолина (продукта) и сопряженной с ним убыли концентрации кинурамина (субстрата). Это позволяло использовать раствор кинурамина в качестве стандарта, измеряя его концентрацию по величине оптической плотности при 360 нм [3].
Статистическую обработку данных выполняли с использованием ¿-критерия Стьюдента. При сравнении малочисленных групп (n < 10) использовали непараметрические Т-критерий Уайта и Х-критерий Ван-дер-Вардена. В качестве критерия достоверности принималиp < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследованные структуры можно расположить в ряд по убыли общей кинураминоксидаз-ной активности, представленный на рис. 2. В таблице 1 приведены уровни значимости, на которых опровергается предположение о том, что разли-
Таблица 1. Уровни значимости (от 0.1 до 5%), на которых опровергаются предположения о случайном характере различий в общей моноаминоксидазной активности между структурами
E R P C M T A
R 0.1
P 0.1 0.1
C 0.1 1 -
M 0.1 0.1 0.1 -
T 0.1 0.1 0.1 - 0.1
A 0.1 0.1 0.1 1 5 -
H 0.1 0.1 0.1 1 1 0.1 1
Таблица 2. Относительный вклад изоформ МАО типов А и В в общую активность (в процентах от общей активности) (М ± SD, п = 6 для каждой группы)
Срединное возвышение Дорсальное ядро шва Преоптическая область Locus coeruleus
МАО А 10 ± 3 27 ± 3 29 ± 4 34 ± 6
МАО В 90 ± 3 73 ± 3 71 ± 4 66 ± 6
чия в моноаминоксидазнои активности между структурами носят случайный характер.
При добавлении R-депренила в реакционную среду была выявлена величина активности МАО, принадлежащая, как следует полагать, к типу А. Достоверных различий по данной активности выявлено не было в отношении всех четырех исследованных структур. Различия в активности МАО В между срединным возвышением и каждой из остальных трех исследованных структур достоверны с вероятностью P > 99%. Предположение о том, что различия между уровнями активности МАО типа В в дорсальном ядре шва и в locus coeruleus с окружающей тканью случайны, опровергается на 5%-ном уровне значимости (рис. 3). Относительный вклад изоферментов (в процен-
□ MAO A
□ MAO B
E
R
C
Рис. 3. Распределение активностей изоформ МАО типов А и В (нмоль окисленного кинурамина/мин/мг белка) среди исследованных структур (М± т, п = 6 для каждой структуры).
тах) в общую активность МАО представлен таблице 2.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Исследование общей кинураминоксидазной активности в восьми исследованных анатомических структурах позволило представить распределение общей активности МАО в тканях мозга и гипофиза крыс. Хотя полученная картина не претендует на полноту, результаты отражают распределение кинураминоксидазной активности среди гораздо менее обширных областей, чем это было описано ранее [5], что увеличивает значимость полученных данных. Причина, позволившая использовать данные анатомические структуры для определения кинураминоксидазной активности, состоит в использ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.