ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 4, с. 479-485
УДК 581.138.1
АКТИВНОСТЬ НАДФН-ОКСИДАЗЫ В КОРНЯХ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА ПРИ РИЗОБИАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ДЕЙСТВИЯ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ
© 2010 г. А. К. Глянько, Г. Г. Васильева, А. А. Ищенко, Н. В. Миронова, А. Л. Алексеенко
Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск, 664033
e-mail: akglyanko@sifibr.irk.ru Поступила в редакцию 06.04.2010 г.
Изучали активность НАДФН-оксидазы в корнях 3- и 4-суточных этиолированных проростков гороха (сорт Аксайский усатый) в зависимости от инокуляции растений Rhizobium leguminosarum bv. viceae (штамм CIAM 1026) и действия неблагоприятных абиотических факторов — низкой температуры, высокой дозы минерального азотного удобрения, химических соединений — нитропруссида Na, метилвиологена (паракват) и биотического фактора — бактерии Escherichia coli (штамм XL-1Blue). Показано, что все экзогенные факторы увеличивали активность микросомальной НАДФН-оксидазы. Ризобиальная инфекция снимала активирующее влияние экзогенных факторов на НАДФН-оксидазу только в случае высокой дозы азота в среде, проявляя антагонистическое действие. В варианте с совместным действием ризобий с паракватом и ризобий с Escherichia coli наблюдался синергический эффект. Повышение активности НАДФН-оксидазы в корнях совпадало с угнетением роста корней проростков гороха. Результаты обсуждаются в связи с ролью НАДФН-ок-сидазы и активных форм кислорода в бобово-ризобиальном симбиозе.
НАДФН-оксидаза (КФ 1.6.99.6) — стартовый фермент НАДФН-оксидазной сигнальной системы [1], связывающий, по крайней мере, два звена: генерацию активных форм кислорода (АФК) и потоки кальция (Са2+) [2]. АФК и Са2+ являются основными сигнальными элементами механизма регуляции активности мембранной НАДФН-оксидазы у растений.
У фагоцитов фермент состоит из 2 мембранных и 4 цитозольных белковых субъединиц, которые при определенных условиях в клетке образуют ферментный комплекс [3]. У высших растений НАДФН-ок-сидаза включает 1 мембранный белок §р91рЬох, гомологичный животному (N0X2), и 1 цитозольный регуляторный белок Яае-ОТРа8е [2]. НАДФН-ок-сидаза растений — чувствительный, тонко регулируемый посредник, воспринимающий экзо- и эндогенные сигналы и отвечающий на это генерацией АФК [4].
Фермент локализован на плазматической мембране и восстанавливает с участием НАДФН молекулярный кислород О2 с образованием супероксидного анион-радикала О* . В фагоцитарных клетках до 90% потребляемого клетками О2 может
расходоваться на генерацию О 2 (окислительный взрыв). Однако в других клетках такого уровня образования АФК в результате активации НАДФН-оксидазы может не происходить. Образующиеся в этом случае АФК могут действовать прежде всего как сигнальные молекулы. Продукт реакции, ката-
лизируемой НАДФН-оксидазой — супероксидный анион-радикал, служит исходным соединением для синтеза других активированных соединений: пероксида водорода (Н2О2), пероксинитрита ^N00), синглетного кислорода (1О2), гидрок-сильного радикала (НО*-) и др. [3].
НАДФН-оксидаза, локализованная на плазматической мембране, активируется при действии на организмы абиотических и биотических факторов [5]. Образовавшиеся в результате активации этого фермента АФК защищают растение от патогенов путем участия в реакции сверхчувствительности клеток (СВЧ), системной приобретенной и индуцированной устойчивости, в укреплении клеточной стенки как механического барьера на пути инфекции [6]. В отличие от патогенного воздействия на растительный организм, роль АФК в мутуалистиче-ских взаимодействиях, в т.ч. при бобово-ризобиаль-ном симбиозе, до конца не ясна. Поскольку начальные этапы взаимодействия растений с патогенными и симбиотическими микроорганизмами имеют много общего [7], можно предположить, что изменения в активности НАДФН-оксидазы являются одним из механизмов регуляции образования АФК на начальных этапах бобово-ризобиального симбиоза. Так, накопление транскриптов НАДФН-окси-дазы в корнях люцерны (Medicago ШпсаШ1а Ь.) коррелирует с изменением содержания Н2О2 в первые часы после заражения проростков ризобиями [8]. Однако синтетический ризобиальный №ё-фактор уменьшал на 60% уровень Н2О2 в корнях проростков
люцерны спустя 20—30 мин после обработки растений, в то время как обработка проростков патогенным элиситором увеличивала уровень пероксида водорода на 200% [9]. По данным этих же авторов [9], ингибитор НАДФН-оксидазы дифенилен йодо-ний снижал активность фермента, что выразилось в уменьшении уровня Н2О2 до 20% от контроля как в случае обработки проростков ризобиальным N0^ фактором, так и патогенным элиситором.
Таким образом, можно предполагать об участии НАДФН-оксидазного ферментного комплекса в процессах, связанных с инфекцией и нодуляцией при бобово-ризобиальном симбиозе. Однако в естественных условиях бобово-ризобиальный симбиоз подвергается воздействию различных факторов и их действие на симбиоз может быть более значительным, чем суммарное влияние обоих партнеров [10]. В число этих факторов входят, в частности, пониженная температура почвы в начале вегетации растений, а также гербициды и высокие дозы азотных минеральных удобрений, применяемые человеком. Не исключено влияние на бобово-ризобиальный симбиоз почвенной микрофлоры и микоризы. Эти неблагоприятные факторы вызывают усиление генерации растениями АФК [11], что, как можно предполагать, связано с увеличением активности НАДФН-оксидазы. Однако влияние этих факторов при бобово-ризобиальном симбиозе на активность НАДФН-оксидазы практически не изучено.
Установлено, что предобработка корней синтетическим №ё-фактором уменьшала генерацию Н2О2 корнями растений, вызванного действием на растения элиситора патогена [9]. Инокуляция проростков гороха эффективным штаммом клубеньковых бактерий в 2 раза снижала накопление Н2О2 в корнях, вызванное обработкой растений экзогенной салициловой кислотой [12]. По данным этих же авторов [12] инокуляция ризобиями также смягчала отрицательное действие на рост растений гороха экзогенной Н2О2. Показано, что ризобиальный №ё-фактор способен супрессировать накопление у бобовых растений салициловой кислоты и АФК [13, 14].
На основании этих литературных данных можно заключить, что ризобиальная инокуляция бобовых может существенным образом модифицировать обмен веществ растения-хозяина, направленное, по-видимому, на создание оптимальных условий для инфекции и нодуляции. В этой связи представляет интерес изучение влияния абиотических и биотических факторов на физиологические процессы, играющие существенную роль в установлении бобо-во-ризобиального симбиоза. К таким процессам, по-видимому, относится и функциональная активность НАДФН-оксидазы, физиологическая роль которой связана с генерацией АФК.
Цель работы — выяснение способности ризоби-альной инфекции изменять функциональную активность растительной НАДФН-оксидазы на фоне
действия на проростки гороха неблагоприятных экзогенных факторов.
МЕТОДИКА
Опыты проводили с горохом посевным (Pisum sativum L.), сорт Аксайский усатый. Семена перед проращиванием промывали в теплой мыльной воде и стерилизовали 3%-ным раствором пероксида водорода в течение 15 мин. Семена проращивали при температуре 22°С в термостате в кюветах на влажной фильтровальной бумаге в течение 2 сут. Инокуляцию корней исходных проростков проводили суспензией клеток эффективного производственного штамма CIAM 1026 Rhizobium leguminosarum bv. viceae (1 мл/проросток) в концентрации 2 х 108 кл./мл. (Штамм получен из ВНИИ с.-х. микробиологии РАСХН, Санкт-Петербург, Россия). Инфицирование исходных проростков условно-патогенной бактерией Escherichia coli, штамм XL-1Blue, проводили 1-суточной культурой клеток в концентрации 108 кл./мл (1 мл суспензии/проросток).
Инокулированные и неинокулированные (контроль) проростки помещали для дальнейшего роста в термостат либо с низкой положительной (8°С), либо с оптимальной (22°С) температурой. Растворы KNO3 (60 мМ), нитропруссида натрия (4 мМ) и ме-тилвиологена (10-6 М) вносили в кюветы с иноку-лированными или неинокулированными проростками. Через 1 и 2 сут после воздействия факторов выделяли из корней субклеточную микросомаль-ную фракцию методом дифференциального центрифугирования [15]. Для этого свежие корни (4—5 г) тщательно промывали дистиллированной водой, нарезали и гомогенезировали в предварительно охлажденной во льду ступке с 50 мМ HEPES-KOH буфером (рН 7.8), содержащим 250 мМ сахарозу и 1 мМ ЭДТА. Гомогенат фильтровали через капроновую ткань и центрифугировали (600 g, 15 мин) для осаждения тяжелых органелл и компонентов клетки. Надосадочную жидкость центрифугировали при 42000 g в течение 20 мин для осаждения митохондрий. Полученный супернатант центрифугировали в течение 1 ч при 140000 g для разделения на цитозольную (супернатант) и микросомальную (осадок) фракции. Осадок суспендировали в буфере, использованном для гомогенизации корней. В полученной микросомальной фракции определяли НАДФН-оксидазную активность по методу [16]. Для этого к реакционной среде, состоящей из 0.8 мл буфера (50 мМ ^PES-RO^ рН 7.8); 0.1 мМ ЭДТА и 1 мкМ KCN, добавляли 0.2 мл пробы и прединку-бировали 1 мин при 30°С. Реакцию инициировали добавлением 100 мкМ НАДФН, скорость окисления которой регистрировали на спектрофотометре Specord S-100 (Германия) по уменьшению величины D340 в течение 5 мин и рассчитывали с коэффициентом экстинции 6.22 мМ-1 см-1. Содержа-
Таблица 1. Влияние экзогенных факторов на активность НАДФН-оксидазы в микросомальной фракции корней неинокулированных Rhizobium проростков гороха
Фактор Возраст, сут Активность фермента,
нмоль мг 1белка мин 1 % от контроля
Контроль (22°С) 3 31.6 ± 1.37 100
4 26.4 ± 1.64 100
Низкая температура (8°С) 3 53.3 ± 4.54 169**
4 54.6 ± 6.64 206**
Высокая доза минерального азота 3 48.4 ± 1.33 155**
4 29.9 ± 2.50 113
Нитропруссид натрия (4 мМ) 3 41.0 ± 1.01 130**
4 33.7 ± 1.66 127*
Метилвиологен (10-6 М) 3 43.3 ± 2.99 137**
4 44.6 ± 2.84 169**
Escherichia coli 3 46.8 ± 1.68 151**
4 44.1 ± 4.08 166**
* Различие дост
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.