УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2012, том 132, № 6, с. 601-610
УДК 591.69-7-51
АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ РЫБ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ЦЕСТОДАМИ
© 2012 г. Г.И. Извекова1, М.М. Соловьев2
1 Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, Борок, Ярославская обл. 2Институт систематики и экологии животных СО РАН, Новосибирск E-mail: izvekov@ibiw.yaroslavl.ru
Представлены данные по влиянию заражения цестодами на активность пищеварительных ферментов их хозяев-рыб. Подтверждено существование градиентов активности протеиназ и гликозидаз вдоль кишечников рыб. Установлено, что протеиназы хозяев более чувствительны к заражению цестодами, чем гликозидазы. У леща и налима заражение приводит к снижению протеолитической активности, у щуки - к ее повышению. Изменяются как абсолютные значения ферментативной активности, так и соотношение уровней активности исследованных ферментов. При заражении леща изменяется относительное содержание различных подклассов протеиназ, особенно сильно в отделах с максимальным числом червей. У зараженного налима активность протеолитических ферментов значительнее уменьшается в месте прикрепления червей - пилорических придатках. Снижение активности пищеварительных ферментов хозяина отмечено даже при низкой инвазии.
Ключевые слова: рыбы, цестоды, пищеварение, ферменты.
ВВЕДЕНИЕ
Пищеварительные ферменты всех позвоночных животных, в том числе рыб, характеризуются определенной локализацией в стенке и вдоль просвета кишечного тракта. Как правило, распределение и уровень активности этих ферментов варьируют в зависимости от типа питания и морфологии кишечника рыб (Уголев, Кузьмина, 1993; Бе^иата et а1., 2003; Ьи^еЛ et а1., 2004; БЫап et а1., 2004).
Распределение ферментов в слизистой оболочке кишечника рыб неравномерно. Описаны как проксимо-дистальные, так и радиальные градиенты активности пищеварительных гидролаз. Многочисленные сведения о градиентах различных ферментов слизистой оболочки кишечника рыб одного вида, а также о распределении активности одного и того же фермента у рыб разных видов в значительной мере противоречивы (Уголев, Кузьмина, 1993). В то же время отмечены и некоторые закономерности в существовании градиентов. Так, мембранный гидролиз жиров осуществляется главным образом в проксимальном отделе кишечника и пилорических придатках, а гидролиз углеводных и белковых компонентов пищи -в медиальном и дистальном отделах кишечника (Кузьмина, 2005).
Одним из факторов, влияющих на уровень активности пищеварительных ферментов, может быть
заражение паразитами, и в частности цестодами. Для цестод, паразитирующих в кишечнике, характерно активное взаимодействие с пищеварительной системой и влияние на нее в силу морфологического сходства их тегумента с энтероцитами кишечника, а также большей, по сравнению с другими гельминтами, биомассы и площади поверхности, принимающей участие в пищеварительно-транс-портных процессах (Куперман, 1988). Заражение паразитами может ограничивать возможности приема пищи у хозяев, что влечет за собой изменение каталитической способности ферментов кишечника. У цестод отсутствует полостное пищеварение - первая стадия пищеварения, имеющаяся у позвоночных животных. Паразиты этой группы, обладая механизмами мембранного пищеварения и активного транспорта, способны использовать не только пищевые субстраты хозяина и продукты его первой стадии пищеварения, но также ферменты хозяина, адсорбированные на поверхности тела червей (1гуекоуа et а1., 1997).
Однако работы по влиянию цестод на активность пищеварительных ферментов хозяев малочисленны. Отмечено снижение сахаразной активности в слизистой оболочке кишечника крыс при паразитировании В1рроз1топ£у1т ЬгазШеп-згз, Етепа тезеНыЫ или совместной инвазии этих паразитов (МауЪеггу et а1., 1986). Показано, что кишечные градиенты некоторых нутриентов
сильно отличаются у зараженных Hymenolepis diminuta и здоровых животных (Mettrick, 1971; Mettrick, Podesta, 1974).
Также немногочисленны работы, касающиеся влияния цестод на активность пищеварительных ферментов хозяев-рыб. Показано снижение активности амилазы, протеазы и кислой фосфатазы в слизистой и содержимом кишечника сеголеток карпов при заражении Both-riocephalus acheilognathi (Давыдов, Куровская, 1991; Куровская, 1991). Установлено влияние заражения цестодами Caryophyllaeus laticeps на активность основных гидролитических ферментов их хозяина-леща (Извекова и др., 2011).
Цель работы - изучить распределение активности пищеварительных ферментов (протеиназ и гликозидаз) вдоль кишечников различных видов рыб, обобщить полученные ранее данные и установить степень влияния заражения цестодами на уровень активности этих ферментов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили следующие виды рыб: лещ Abramis brama (Linnaeus), щука Esox lucius Linnaeus, налим Lota lota (Linnaeus), незараженные и зараженные цестодами Caryo-phyllaeus laticeps (Pallas), Triaenophorus nodulo-sus (Pallas) и Eubothrium rugosum (Batch) соответственно.
Caryophyllaeus laticeps - типичный представитель группы монозоичных ленточных червей, заканчивающий свое развитие в кишечнике карповых рыб. Основной окончательный хозяин червей - лещ. Цестоды C. laticeps имеют нерасчле-ненное тело с одним комплексом половых органов, длина половозрелых червей 20-40 мм (Протасова и др., 1990).
Triaenophorus nodulosus - часто встречающийся и широко распространенный вид рода Triaenophorus, окончательный хозяин - щука (Ку-перман, 1973). Длина зрелых червей колеблется от 100 до 200 мм. В кишечнике щуки черви обитали в 1-4 отделах, масса червей у зараженных щук колебалась от 0.54 до 2.2 г.
Eubothrium rugosum - паразит налима, в кишечнике которого популяция E. rugosum представлена червями, находящимися на разных стадиях полового развития и созревания. Значительная часть червей способна после частичной дестробиляции регенерировать и вновь формировать инвазионные яйца. Головной конец червей прикрепляется в пилорических придатках кишечника налима, а стробила выходит в его среднюю часть (Куперман, 1978). У зараженных рыб определяли массу чер-
вей. По степени зараженности E. rugosum налимы были разделены на 3 группы: I - незараженные,
II - слабо зараженные с массой червей 0.44-0.8 г,
III - сильно зараженные с массой червей 1.062.85 г.
У исследованных видов рыб извлекали кишечник, вскрывали его, удаляли химус, а затем, в зависимости от длины кишечника, делили его у леща на 7 отделов по 4-5 см длиной; у щуки - на 5 отделов (суммарная длина первых четырех отделов составляла примерно две трети кишечника, 5 отдел - дистальный); у налима - на 4 отдела (1-ый отдел - пилорические придатки, 2-ой-4-ый отделы - отрезки кишечника по 3-4 см длиной). Из слизистой каждого отдела готовили гомогенат и определяли активность пищеварительных ферментов.
В кишечниках леща и щуки определяли суммарную активность протеиназ (активность трипсина КФ 3.4.21.4, химотрипсина КФ 3.4.21.1 и дипепти-даз КФ 3.4.13.1-3.4.13.11) с использованием 0.3% азо-казеина в качестве субстрата (Alarcon et al., 2002). Для идентификации различных подклассов протеиназ применяли следующие ингибиторы: 1) PMSF (фенил-метил-сульфонил-флуорид) - ингибитор сериновых протеиназ, 2) EDTA (этилен-диаминтетрауксусная кислота) - ингибитор ме-таллопротеаз, и 3) Е-64 - ингибитор цистеиновых (тиоловых) протеиназ. Активность амилазы (КФ 3.2.1.1) определяли методом Бернфелда (Deguara et al., 2003) с 1% растворимым крахмалом в качестве субстрата. Активность исследованных ферментов выражали в условных единицах (разность показаний спектрофотометра пробы с субстратом и холостой пробы на грамм влажной навески слизистой кишечника за минуту).
В кишечниках налима определяли активность гликозидаз (суммарная активность а-амилазы, КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы, КФ 3.2.1.3 и ферментов группы мальтаз, КФ 3.2.1.20) методом Нельсона (Исследование..., 1969). В качестве субстрата использовали 1.8%-ный раствор растворимого крахмала, рН 7.5. Общую протеолитическую активность (активность трипсина, КФ 3.4.21.4, химотрипсина, КФ 3.4.21.1 и дипептидаз, КФ 3.4.13.1-3.4.13.11) определяли методом Ансона (Anson, 1938). В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор казеина, рН 7.5. Активности ферментов выражали в мкмоль/гхмин.
Для леща и щуки вычислен коэффициент А/П (отношение активности амилазы к активности протеаз), а для налима - коэффициент Г/П (отношение активности гликозидаз к активности протеаз) в зависимости от заражения цестодами.
Обработка результатов выполнена с помощью статистического пакета "Microsoft Excel".
АКТИВНОСТЬ ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫХ ГИДРОЛАЗ РЫБ ПРИ ЗАРАЖЕНИИ ЦЕСТОДАМИ 603 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Лещ - СатуоркуНаеш ¡аИеерз
Установлено, что вдоль кишечников зараженных лещей цестоды распределяются неравномерно. В 1-м отделе кишечника черви отсутствуют, наибольшее их количество (от 7 до 20 штук) обнаружено в 3-м и 4-м отделах.
Активность пищеварительных гидролаз проявляется на всем протяжении кишечника, как у зараженных, так и у незараженных особей (табл. 1). Наибольшая общая протеолитическая активность у незараженных лещей обнаружена в 5-6-м отделах, от 1-го к 5-му отделу она увеличивается. Более высокая активность амилазы у незараженных лещей
отмечена в 3-м и 7-м отделах, а самая низкая - во 2-м. Прослеживается тенденция к уменьшению активности пищеварительных гидролаз в большинстве отделов при заражении леща цестодами C. laticeps. Однако связи между распределением червей вдоль кишечника и уровнями активности пищеварительных гидролаз не обнаружено.
Установлено, что при заражении леща цестода-ми не только снижается активность протеаз, но и изменяется соотношение активностей различных их подклассов в каждом исследованном отделе (табл. 2). У зараженных особей в большинстве отделов увеличивается относительное содержание сериновых, цистеиновых и металлопротеиназ (особенно значительно - у двух последних подклассов) и понижается доля прочих протеиназ.
Таблица 1. Протеолитическая активность и активность а-амилазы в различных отделах кишечника незараженных и зараженных С. ¡aticeps лещей (усл. ед.)
Отдел ки
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.