ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 702-706
УДК 581.138.1
АКТИВНОСТЬ САХАРОЗОСИНТАЗЫ И КИСЛОЙ ИНВЕРТАЗЫ В ОРГАНАХ ПРОРОСТКОВ ГОРОХА
© 2004 г. Р. К. Брускова, Р. Ф. Зартдинова, М. В. Сацкая, С. Ф. Измайлов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 08.04.2003 г.
Исследована органная топография сахарозосинтазы и кислой растворимой инвертазы у проростков гороха в период их гетеротрофного питания (3-14 сут). Наибольшая активность сахарозосинтазы с максимумом в 6-8-дневном возрасте наблюдали в корнях. В листьях ее активность снижалась от 3 к 14 сут роста. В стеблях активность сахарозосинтазы находилась на постоянно низком уровне. У этиолированных и зеленых растений характер кривых изменения активности сахарозосинтазы был сходным. В отличие от сахарозосинтазы кислая инвертаза обладала наибольшей активностью в стебле, особенно у этиолированных растений, с пиком на 6-8-е сутки. Кривые изменения ее активности в листьях имели тот же вид, но характеризовались более низким значением величин. Активность кислой инвертазы в корне снижалась, начиная с 3-х суток роста и не зависела от освещения. Делается вывод, что различия в развитии активности сахарозосинтазы и кислой инвертазы в корнях, листьях и стебле обусловлены как интенсивностью импорта продуктов гидролиза запасов семядолей, так и избирательной потребностью в них этих органов для процессов роста растяжением и поддержания конституционного обмена веществ.
Pisum sativum - органы проростков - сахарозосинтаза - кислая растворимая инвертаза - свет -темнота
Сахароза, синтезирующаяся в листьях, является основной транспортной формой восстановленного углерода в растении и служит основой для метаболизма в потребляющих органах. В растительных тканях функционируют два стартовых фермента, ответственных за метаболизм сахарозы. Это кислая и щелочная инвертазы (К.Ф. 3.2.1.26), гидролизирующие дисахарид с освобождением нефосфорилированных глюкозы и фруктозы в соответствии с реакцией:
сахароза + Н20 —► глюкоза + фруктоза
и сахарозосинтаза (К.Ф. 2.4.1.13), катализирующая обратимую реакцию синтеза/разложения сахарозы:
сахароза + УДФ о УДФглюкоза + фруктоза.
Инвертазы функционируют в разных отделах клетки: кислая растворимая - в вакуоли, кислая нерастворимая - в клеточной стенке, щелочная -в цитозоле [1]. Сахарозосинтаза обнаружена только в цитозоле, и во многих случаях, например, у проростков, служит для разложения сахарозы [2]. При изучении активностей сахарозосин-
Адрес для корреспонденции: Брускова Роксана Константиновна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (095) 977-80-18; электронная почта: nitrogenexchange@mail.ru
тазы и инвертазы у различных растительных объектов было обнаружено временное их несовпадение в разных органах растения. А именно, при низкой или снижающейся активности в том или ином органе одного из ферментов наблюдалась высокая или возрастающая активность в нем другого. Такие факты наблюдались, в частности, на стадии формирования хозяйственно важных органов - в зерновках пшеницы при их наливе [3, 4], при формировании плодов томата [5, 6], созревании стручков фасоли [7], в онтогенезе клубней картофеля [8] и при их хранении [9]. Аналогичная временная закономерность несовпадения активностей сахарозосинтазы и кислой инвертазы обнаружена в азотфиксирующих корневых клубеньках сои и гороха [10, 11].
Различия в направленности и продуктах реакции, в компартментации и проявлении активностей во времени предполагают выполнение саха-розосинтазой и инвертазой неодинаковых функций. В частности, принято считать, что при метаболизации сахарозы инвертаза и сопряженные с ней ферменты определяют преимущественно катаболический, а сахарозосинтаза - преимущественно анаболический путь [8].
При изучении инвертазы и сахарозосинтазы с точки зрения понимания их функций эффективным приемом является анализ динамики активности этих ферментов в различных органах на раз-
ных этапах онтогенеза, когда одновременно изменяются метаболизм этих органов и донорно-акцепторные отношения в системе целостного растительного организма.
Цель настоящей работы - сравнительный анализ органного распределения активностей саха-розосинтазы и растворимой кислой инвертазы на ранней стадии развития гороха, когда его углеродное и азотное питание является в основном гетеротрофным.
МЕТОДИКА
Выращивание растений. Объектом исследования служили растения гороха (Pisum sativum L.) сорта Труженик. Семена проращивали в рулоне фильтровальной бумаги в течение 3 сут в темноте при температуре 25-27°С. Затем проростки переносили в сосуды емкостью 5 л на жидкую питательную среду (макроэлементы - 1/2 среды Кнопа, микроэлементы - 1/2 среды Уайта). В один сосуд высаживали по 50 растений, смену питательного раствора производили 2 раза в неделю. Дальнейший рост растений проходил в климатических камерах при температуре 24-26°С днем и 20-22°С ночью, относительной влажности воздуха 70%, с постоянным продуванием воздухом, в темноте или при 16-часовом фотопериоде до 14 сут.
Выделение сахарозосинтазы и кислой инвертазы. Проростки гороха в возрасте 3-14 сут разделяли на корни (с гипокотилем), листья и стеблевые части. Для выделения сахарозосинтазы навеску 1-4 г гомогенизировали в ступке в среде, состоящей из 50 мМ Трис-НС1-буфера (рН 7.5) и 20 мМ 2-меркаптоэтанола при температуре 4°С. Для выделения кислой инвертазы использовали 25 мМ ацетатный буфер (рН 4.7). Соотношение навески и буфера составляло 1 : 2 (г/мл). Гомоге-нат настаивали в течение 1 ч при температуре 4°С. Далее для определения активности сахарозосинтазы его центрифугировали в течение 20 мин при 15 000 g, а для определения активности кислой инвертазы - 15 мин при 5000 g . Надосадоч-ную жидкость, пропущенную при центрифугировании через колонки (2 х 6 см) с Sephadex G-25 (coarse, "Loba", Австралия), использовали в качестве ферментных препаратов. Активность кислой инвертазы определяли в день выделения, активность сахарозосинтазы - на следующий день. До определения активности ферментные препараты хранили в холодильнике в воде со льдом.
Определение активности сахарозосинтазы проводили в реакции синтеза сахарозы в реакционной смеси общим объемом 0.2 мл, содержащей 50 мМ Трис-НС1-буфер (рН 7.5); 2.5 мМ УДФглю-козу; 10 мМ фруктозу; 13 мМ MgSO4 и ферментный препарат (15-150 мкг белка). Контролем служила реакционная смесь без УДФглюкозы. Реак-
цию проводили при 37°С в течение 15 мин и останавливали трехминутным нагреванием инкубационных пробирок на кипящей водяной бане. Количество синтезированной сахарозы определяли по Яое [12] в микромодификации Павлино-вой и Прасоловой [13]. Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили на спектрофотометре Specol 21 (Германия) при 520 нм. Активность сахарозосинтазы выражали в микромолях сахарозы, синтезированной за 1 мин в расчете на 100 мг сухой массы.
Определение активности кислой инвертазы осуществляли по образованию глюкозы. Реакционная смесь общим объемом 0.2 мл содержала 20 мМ сахарозу, 65 мМ ацетатный буфер (рН 4 .7) и ферментный препарат (30-100 мкг белка). Контролем служила реакционная смесь без сахарозы. Реакцию проводили в течение 15 мин при температуре 30°С. Инактивацию фермента проводили как и в опыте с сахарозосинтазой. Количество образованной глюкозы определяли глюкозоокси-дазным методом [14] с набором реагентов "Glu-cose-12" фирмы "Olvex diagnosticum" (Россия). Измерение оптической плотности окрашенных растворов проводили на спектрофотометре Specol 21 при 500 нм. Активность кислой инвертазы выражали в микромолях глюкозы, образованной за 1 мин в расчете на 100 мг сухой массы.
Содержание белка определяли методом Bradford [15].
Опыты по определению динамики активности сахарозосинтазы и кислой инвертазы в органах гороха проводили дважды в разные сезоны года. В каждом опыте анализировали навески того или иного органа, полученные от 20-50 растений. В обоих опытах были получены сходные результаты, поэтому на рис. 1 и 2 представлены результаты одного из двух опытов. Для построения графиков использовали средние арифметические из четырех аналитических повторностей опыта и их стандартные ошибки. На рис. 3 представлены данные одного опыта, в котором анализировали навески от 10 растений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
На рис. 1 представлены данные об активности сахарозосинтазы в различных органах проростков гороха, выращенных в условиях темноты или 16-часового фотопериода. В возрасте 3 сут (от начала набухания семян) активность фермента преобладала в зачаточных листьях, далее в порядке убывания следовали корни с гипокотилем и стебель. Затем активность сахарозосинтазы в корнях резко возрастала, достигая максимума к 6-8-м суткам и снижалась до минимальных значений к 12-14-м суткам. В листьях наибольшую активность сахарозосинтазы наблюдали в возрасте 3 сут,
0 4.0
(а)
_|_I_I_I_|_
(б)
2 4 6 8 10 Возраст растений, сут
2 4 6 8 10 Возраст растений, сут
12 14
Рис. 1. Активность сахарозосинтазы в органах проростков гороха.
а - темнота; б - 16-часовой фотопериод. 1 - корни с гипокотилем; 2 - стебель, 3 - листья.
Рис. 2. Активность кислой растворимой инвертазы в органах проростков гороха.
а - темнота; б - 16-часовой фотопериод. 1 - корни с гипокотилем; 2 - стебель, 3 - листья.
после чего она плавно снижалась. Стебель характеризовался достаточно стабильным уровнем активности сахарозосинтазы, который, однако, был ниже, чем в корнях. К концу двух недель активность фермента во всех органах растений была низкой и не отличалась по величине. Таким образом, активность сахарозосинтазы у гороха преобладала в корнях, превосходя в пике (на 6-8-е сутки) другие органы в 3-7 раз. Условия освещения не влияли на характер кривых.
Распределение активности кислой инвертазы по органам было иным (рис. 2). Максимальные ее значения были выявлены в стебле, особенно у этиолированных растений, с пиком в 6-8-дневном возрасте. При 16-часовом фотопериоде в стебле такого пика не наблюдали. Максимальная величина активности фермента приходилась на 3-6-дневный в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.