ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2011, № 3, с. 358-363
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 599.742.4;591.366
АКТИВНОСТЬ СИСТЕМЫ ГИПОТАЛАМУС-ГИПОФИЗ-НАДПОЧЕЧНИКИ У АМУРСКИХ ТИГРОВ (Panthera tigris altaica) В НЕВОЛЕ И В ПРИРОДЕ И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЕ В ТЕЧЕНИЕ ГОДА
© 2011 г. С. В. Найденко*, Е. А. Иванов*, В. С. Лукаревский*, Х. А. Эрнандес Бланко*, П. А. Сорокин*, М. Н. Литвинов**, А. К. Котляр**, В. В. Рожнов*
*Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН,
119071 Москва, Ленинский просп., 33 **ГПЗ "Уссурийский" ДВО РАН, 692519 Уссурийск, ул. Некрасова, 1 E-mail: snaidenko@mail.ru Поступила в редакцию 22.11.2010 г.
Подтвержден неинвазивный метод оценки активности системы гипоталамус-гипофиз—надпочечники (ГГНС) у амурского тигра. Проведено сравнение уровня активности ГГНС у амурских тигров в природе и неволе и его изменений на протяжении года. В неволе не выявлено значительных сезонных различий в уровне активности ГГНС у тигра. В природе этот уровень был значительно выше, при этом достигал максимума в ноябре—январе, что может быть связано с неблагоприятным воздействием на тигра низких температур и глубокого снежного покрова.
Амурский тигр (Panthera tigris altaica) — подвид, обитающий на краю видового ареала в субоптимальных для вида условиях, при которых негативное воздействие отдельных факторов с большей вероятностью может вести к увеличению активности системы гипоталамус-гипофиз—надпочечники (ГГНС), а, следовательно, подавлению размножения и даже гибели животных. Численность амурского тигра на территории России не превышает 450 особей, а по результатам учетов последних лет (2006—2009 гг.) наблюдается ее снижение. Мониторинг состояния популяции этого подвида, в том числе и оценка степени благополучия животных (animal welfare), является необходимым условием сохранения амурского тигра в природе.
Основным подходом к мониторингу степени благополучия амурских тигров в природе может служить оценка уровня активности ГГНС. При этом могут использоваться неинвазивные методы без непосредственных контактов с животными. Это особенно важно при работе с таким редким животным как амурский тигр, ведущим скрытный образ жизни.
Однако применение неинвазивного метода оценки гормонального статуса животных затруднено особенностями видового метаболизма гормонов (Dehnhard et al., 2010). Кроме того, в разных лабораториях используют антитела различных производителей, что зачастую не позволяет проводить сравнения абсолютных значений (Jew-genow et al., 2006). Это требует определения в каждой лаборатории базальной концентрации того
или иного гормона на основе представительных рядов данных.
Использование неинвазивного подхода требует также валидации метода и подтверждения возможности использования тех или иных антител. В первую очередь это касается оценки уровня активности ГГНС. Для представителей семейства кошачьих наиболее часто применяют методы радиоиммунного анализа (РИА) с использованием антител к кортикостерону (Graham, Brown, 1996; Brown, 2006) или иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием антител к 11,17-диоксо-андростанам (11,17-ДОА) (Schatz, Palme, 2001) или к кортизолу (Young et al., 2004; Павлова, Найденко, 2008). Как показано нами ранее (Рожнов и др., 2010), ИФА с использованием антител к кор-тикостерону служит надежным подходом для не-инвазивной оценки уровня активности ГГНС у амурского тигра. Использование антител к кортизолу и доступных коммерческих наборов для его определения в силу относительно дешевой стоимости таких анализов позволяет проводить исследование серийных сборов, в том числе и от одних и тех же животных в природе. Однако для оценки получаемых данных в лаборатории необходимо оценить базальный уровень глюкокорти-коидов в экскрементах с использованием тех же самых антител.
Цель исследования — оценить возможности использования антител к кортизолу для неинва-зивного мониторинга уровня активности ГГНС амурских тигров, выявить сезонную динамику ба-зальной концентрации иммунореактивных ве-
ществ (ИРВ), связывающихся с антителами к кортизолу (ИРВ-кортизол), в экскрементах амурского тигра в неволе, а также сравнить концентрации ИРВ-кортизол в экскрементах животных в природе и неволе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Оценку уровня активности ГГНС с помощью антител к кортизолу проводили в экспериментах с искусственной стимуляцией ГГНС при введении адренокортикотропного гормона (АКТГ) и транспортировке животного. Влияние последней на развитие стрессового состояния животных представляется очень важным, так как актуальна задача реабилитации изъятых из природы тигрят-сирот и последующего возвращения их в природу, что требует транспортировки животных. Методика проведения экспериментов детально описана ранее (Рожнов и др., 2010).
Экстракцию стероидных гормонов проводили по стандартной методике (Jewgenow et al., 2006; Павлова, Найденко, 2008). На электронных весах фирмы "Ohaus" (США) взвешивали 0.1 г экскрементов в пробирке Эппендорфа и добавляли туда 0.1 г трехвалентного оксида алюминия, а для начала экстракции — 0.9 мл 90%-ного метанола. Пробирки встряхивали на протяжении 30 мин при помощи перемешивающего устройства фирмы "Экрос" (Россия). После этого пробирки центрифугировали в течение 10 мин при скорости 4000 об./мин. В отдельную пробирку многоразовой пипеткой отбирали 200 мкл супернатанта и добавляли 200 мкл дистиллированной воды. Отобранные аликвоты экстракта хранили при температуре —18°С до проведения измерений.
Концентрацию гормонов в плазме крови и экскрементах животных определяли методом гетерогенного ИФА с помощью планшетного спектрофотометра Multiscan EX (ThermoElectron Corporation, Финляндия), измеряя оптическую плотность в ячейках планшета при длинах волн 450 и 620 нм и сравнивая ее со стандартными значениями. Измерения проводили в дубликатах, определяя коэффициент вариации (CV). При CV более 5% измерения проводили повторно, при CV менее 5% принимали их среднее значение для дальнейшего анализа.
Для определения уровня кортизола использовали наборы "ИммуноФА_Кортизол" (Иммуно-тех, Россия). Кросс-реактивность использованных антител к кортизолу составила 6% для пред-низолона, для всех остальных протестированных стероидов — менее 1%. Расчет концентрации ИРВ-кортизола проводили на 1 г сухих экскрементов. Средний CV составил для образцов на одной пластинке 1.4% (n = 312), между пластинками — 4.6% (n = 8).
Для оценки сезонной динамики глюкокорти-коидов у 3 самцов и 3 самок амурского тигра из зоопитомника "Сычово" Московского зоопарка еженедельно проводили сбор образцов экскрементов в течение года (декабрь 2008—2009 гг.). Экскременты собирали в течение нескольких часов после дефекации, аликвоты замораживали при температуре —18°С и хранили до проведения экстракции. В природе образцы собирали в заповеднике "Уссурийский" ДВО РАН на ежесуточно посещаемых маршрутах, в зимний период часть образцов собирали в различных точках ареала тигра, отбирая образцы не более чем недельной давности. Хранение образцов и экстракция гормонов, хранение экстракта до момента проведения измерений не отличались от таковых для образцов, собранных в неволе. Концентрацию гормонов рассчитывали на 1 г сухих экскрементов. Всего проанализированы 224 образца, собранных в неволе, и 61 образец, собранный в природе.
При статистической обработке и поиске пиковых значений проводили тест на "выделяющиеся значения" (outliers), выявляя значения, превышающие средние величины более чем на два среднеквадратичных отклонения (SD). Сравнение концентраций гормона в природе и неволе проводили с использованием критерия Манна—Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Максимальная концентрация ИРВ-кортизол в экскрементах самца тигра при введении аналога АКТГ зарегистрирована на 2-е сут после инъекции и составила 2848 нг/г экскрементов (рис. 1). При этом средняя базальная концентрация составляла 1033 ± SD539 нг/г (n = 4). Таким образом, пиковая концентрация превышала базаль-ную на величину более чем двух SD.
После иммобилизации и транспортировки самки тигра уровень ИРВ-кортизол возрастал в экскрементах животного через 2 сут при первой дефекации тигра (вес экскремента не более 10 г) (рис. 2). При этом через 4 сут после транспортировки при первой нормальной дефекации уровень ИРВ-кортизол был максимален (2554 нг/г), превышая базальный более чем в два раза (1362 ± SD189 нг/г, n = 2).
Средний уровень ИРВ-кортизол в неволе у самцов и самок тигра варьировал большую часть года в пределах 363—539 нг/г, однако в августе средняя концентрация ИРВ-кортизол у животных составила 783 ± 265 нг/г (рис. 3). Уровень ИРВ-кортизол превышал среднегодовой плюс два SD в этот период (457 ± SD121 нг/г). Резкий подъем уровня ИРВ-кортизол был отмечен у двух из пяти животных, образцы от которых были собраны в этот период. Достоверных различий в концентрации ИРВ-кортизол у тигров в неволе в
360
НАИДЕНКО и др.
3000
2500
. 2000
4 о т
13 1500 р
о м
И 1000 Рч
5
500
-1 Сутки
Рис. 1. Уровень ИРВ-кортизол в экскрементах самца тигра до и после инъекции АКТГ. По оси абсцисс — сутки до и после инъекции гормона.
0
0
1
2
3000 2500
i-I
* 2000 ч о т
ти1500 р
О
к
И 1000 Рч
К
500 0
Рис. 2. Уровень ИРВ-кортизол в экскрементах самки тигра до и после транспортировки. По оси абсцисс — сутки до и после транспортировки.
- Транс | порт ировка | | |
-30246 Сутки
течение года не выявлено (тест Вилкоксона для сопряженных пар для сравнения всех месяцев друг с другом). Уровень ИРВ-кортизол практически не отличался у самцов и самок, подъем в августе отмечен у одной самки и одного самца.
Уровень ИРВ-кортизол у тигров из природы был значительно выше, чем у животных, содержавшихся в зоопитомнике (1286 ± 8Э216 нг/г). При этом уровень ИРВ-кортизол был выше в каждом из проанализированных месяцев (рис. 3). В январе, мае и ноябре эти различия были достоверны. Максимальным уровень ИРВ-кортизол был у тигров в природной популяции в ноябре-январе и составлял 1780-2580 нг/г экскрементов.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Использование неинвазивных подходов для оценки гормонального статуса млекопитающих становится все бол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.