НЕЙРОХИМИЯ, 2009, том 26, № 4, с. 297-301
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 577.17.02
АЛЬФА-МЕЛАНОЦИТСТИМУЛИРУЮЩИЙ ГОРМОН УВЕЛИЧИВАЕТ ЭКСПРЕССИЮ ФАКТОРА РОСТА СОСУДИСТОГО ЭНДОТЕЛИЯ В АСТРОЦИТАХ ГИППОКАМПА КРЫСЫ IN VITRO
© 2009 г. Е. В. Дубышина, Л. С. Иноземцева, Д. Д. Марков, К. А. Яценко, О. В. Долотов*, И. А. Гривенников
Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН, Москва
Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (а-МСГ) является регулятором широкого спектра физиологических процессов и проявляет нейропротекторную активность. В представленной работе показана экспрессия меланокортинового рецептора MC4R в культивируемых астроцитах гиппокампа крысы. Показано двукратное увеличение экспрессии фактора роста сосудистого эндотелия (VEGF) в культивируемых астроцитах гиппокампа крысы через 1 ч после введения а-МСГ в концентрациях от 0.1 до 10 нМ. Одновременное введение селективного антагониста MC4R-HS028 - предотвращало стимуляцию экспрессии VEGF. Полученные данные указывают на возможность реализации нейропро-текторных эффектов а-МСГ путем стимуляции продукции в астроцитах гиппокампа ростовых/нейро-трофических факторов.
Ключевые слова: альфа-меланоцитстимулирующий гормон, меланокортиновыерецепторы, фактор роста сосудистого эндотелия, астроциты, гиппокамп, экспрессия генов, нейропротекция.
ВВЕДЕНИЕ
Альфа-меланоцитстимулирующий гормон (а-МСГ) представляет собой тридекапептид, образующийся из полипептидного предшественника проопиомеланокортина (ПОМК) в центральной нервной системе и ряде периферических тканей позвоночных [1]. Кроме первоначально обнаруженной способности а-МСГ усиливать пигментацию кожи, впоследствии было показано, что данный пептид является регулятором различных физиологических процессов, включая когнитивные функции, пищевое и половое поведение [2, 3]; проявляет противовоспалительные, противомикроб-ные и нейропротекторные эффекты [4-6]. Механизмы действия а-МСГ на ЦНС изучены недостаточно, но предполагается, что нейропротекторные эффекты а-МСГ обусловлены его мощными противовоспалительными свойствами [6]. Так, показано [7], что а-МСГ снижает воспалительный ответ культивируемых астроцитов и оказывает антиапо-птотическое действие через меланокортиновые рецепторы четвертого подтипа (МС4Я), являющегося наиболее распространенным в мозге крысы подтипом меланокортиновых рецепторов [8].
Однако, по-видимому, широкий спектр эффектов а-МСГ на ЦНС не может быть сведен к противовоспалительным активностям данного пептида. Ранее нами было показано, что стабилизированный аналог фрагмента АКТГ/МСГ (4-10) Семакс, обладающий нейропротекторными и когнитивны-
* Адресат для корреспонденции: 123182, Москва, пл. акад. Курчатова, д. 2, e-mail: dolotov@img.ras.ru
ми эффектами, способен регулировать уровни нейротрофического фактора мозга (ВБ№) в ряде отделов головного мозга крысы, включая гиппокамп [9, 10]. Одним из возможных механизмов осуществления нейропротекторных и когнитивных эффектов а-МСГ может быть регуляция продукции в клетках ЦНС нейротрофических или ростовых факторов, важным источником которых являются астроциты [11].
Целью настоящей работы явилось изучение влияния а-МСГ на экспрессию в культивируемых астроцитах гиппокампа крысы гена фактора роста сосудистого эндотелия (УБвР) - полипептида, являющегося не только регулятором ангиогенеза и проницаемости сосудов, но и нейротрофиче-ским/нейропротекторным фактором [12], экспрес-сирующимся во взрослом гиппокампе крысы преимущественно в астроцитах [13]. При этом нами была проведена оценка вовлеченности меланокортиновых рецепторов подтипа МС4Я в регуляцию уровня экспрессии УБвР под действием а-МСГ в первичных культурах астроцитов, полученных из гиппокампа крысы.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Культура астроцитов гиппокампа крысы.
Первичную культуру клеток астроцитов получали согласно стандартной методике [14]. Крыс линии 8рга§ие-Ва%'1еу возраста 1-3 дня умерщвляли с помощью углекислотной асфиксии (5 мин) и помещали на 1 мин в 80% водный раствор этанола. Далее все операции проводили в асептических условиях на
льду. Выделенный мозг помещали в раствор Хэнк-са (ПанЭко, Россия) и далее выделяли гиппокамп, освобождая ткань от оболочек. Выделенную ткань один раз промывали раствором Хэнкса и переносили в HEPES-содержащую культуральную среду DMEM/F-12 (Sigma-Aldrich, США, Cat # D-2906) с 20% эмбриональной сыворотки коровы (HyClone, США) и 2 мМ L-глютамином. Ткань диссоциировали на отдельные клетки механически, затем суспензию клеток центрифугировали (4 мин, 200 g), супернатант сливали, а осадок ресуспендировали в необходимом количестве среды того же состава. Проводили подсчет клеток в камере Горяева и высевали их с плотностью 200 тыс. клеток/см2 на обработанные поли-L-лизином (MP Biomedicals Inc., США) полистироловые чашки Петри (d = 100 мм, Greiner Bio-One Int., ФРГ) и культивировали при 37°C в среде DMEM/F-12, дополнительно содержащей 10% эмбриональной сыворотки коровы, 6 г/л D-глюкозы, 2 мМ L-глютамин, 25 мг/л инсулина, 100 мг/л трансферрина (MP Biomedicals Inc., США), 20 нМ прогестерон, 100 нМ путресцин, 30 нМ селенит натрия, 100 мкг/мл гентамицина (добавки производства Sigma-Aldrich, США, если не указано иначе). Смену культуральной среды производили один раз в 3-4 дня. Пересев клеток проводили в соотношении 1 : 3 после достижения клеточного монослоя. Начиная со второго пересева использовали вышеуказанную культуральную среду, содержащую 5% эмбриональной сыворотки коровы и 10% лошадиной сыворотки (HyClone, США).
Для экспериментов использовали полученные после третьего пересева клетки. Клетки высевали плотностью 100 тыс./см2 на обработанные поли-L-лизином 6-луночные полистироловые культу-ральные планшеты (Nunclon, Дания) в вышеуказанной культуральной среде в объеме 5 мл. После достижения клетками монослоя культуральную среду заменяли на бессывороточную (вышеуказанная среда без сыворотки). После 48 ч инкубации в культуральную среду вводили растворы тестируемых соединений.
Введение пептидов и выделение тотальной
РНК. В ходе эксперимента в соответствующие лунки вводили растворы тестируемых соединений в фосфатно-солевом буфере (ФСБ): а-МСГ (Sigma-Aldrich, США) в объеме 50 мкл на лунку до указанных конечных концентраций, и HS028 (Sigma-Ald-rich, США) в объеме 5 мкл на лунку до концентрации 1 нМ. В качестве контроля вводили равный объем ФСБ. Планшет инкубировали 1 час при 37°С, затем отбирали культуральную среду, клетки промывали холодным (4°C) ФСБ и выделяли тотальную РНК фенол-хлороформным методом с использованием реактива PeqGold TriFast (PeqLab, ФРГ), следуя методике и рекомендациям производителя. Полученную РНК трижды промывали 80% этанолом (4°С), растворяли в 50 мкл воды, свободной от РНКаз и хранили при -80°С. Содержание РНК измеряли спектрофотометрически, и далее
использовали образцы, для которых соотношение оптических плотностей при 260 и 280 нм превышало 1.6.
Обработка проб ДНКазой I. В работе использовали реактивы фирмы "Fermentas" (Литва). В пробирке смешивали водный раствор РНК (1 мкг), 1 мкл буфера для ДНКазы I до конечной концентрации 10мМ Трис-HCl, pH 7.5/25°C, 2.5 мМ MgCl2, 0.1 мМ CaCl2 и доводили объем реакционной смеси до 9 мкл водой Milli-Q. Добавляли 1 мкл ДНКазы I (1 ед/мкл), перемешивали, осаждали капли кратковременным центрифугированием и инкубировали 30 мин при температуре 37°С. Реакцию останавливали добавлением 1 мкл 25 мМ ЭДТА и прогреванием смеси в течение 10 мин при температуре 70°С.
Обратная транскрипция (ОТ) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Обратную транскрипцию проводили с использованием набора фирмы "Си-лекс" (Россия) согласно протоколу и рекомендациям производителя. Отбирали по 0.25 мкг тотальной РНК и проводили реакцию 1 час при 37°С в 25 мкл смеси, содержащей 1 мкл случайных гексапрайме-ров (0.5 мкг/мл), 100 ед Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV)-обратной транскриптазы, 4 мкл смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) (1.5 мМ) и 2.5 мкл буфера (700 mM Трис-HCl, pH 8.3, 166 mM (NH4)2SO4, 75 mM MgCl2). После финальной инкубации 10 мин при 70°С, образцы кДНК хранили при -20°С.
Оценку уровней мРНК для VEGF и детекцию экспрессии МС4Я проводили с использованием набора реагентов фирмы "Силекс" (Россия) в ДНК-амплификаторе "Терцик" (ДНК-Технология, Россия) в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл раствора кДНК или негативной пробы (см. ниже), 2.5 мкл Taq-буфера (700 mM Трис-HCl, pH 8.6, 166 mM (NH4)2SO4, 25 mM MgCl2), 2 мкл смеси дНТФ (1.5 мМ), 1.25 ед colored Taq-полимеразы, и по 10 пмоль каждого праймера (Евроген, Россия; таблица). Для проверки на наличие в пробах геномной ДНК при проведении обратной транскрипции в пробу вместо M-MLV-обратной транскриптазы вносили эквивалентный объем воды Milli-Q (негативная проба).
ПЦР проводили при следующих условиях: старт - 5 мин 95°C, 29-40 циклов, включающих 45 сек при 95°C, 45 сек при 64°-68°C (отжиг прайме-ров), 45 сек при 72°C; финальная инкубация 10 мин при 72°C (таблица). Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 2% агарозном геле с визуализацией в ультрафиолетовом свете с использованием бромистого этидия. С помощью системы BioDocAnalyze (Biometra, ФРГ) определяли интенсивность свечения продукта и получали значения исходных относительных количеств соответствующих кДНК. Нормализацию уровня экспрессии гена VEGF (уровни мРНК для различных изо-форм VEGF [15]) проводили относительно уровня
Последовательности использованных в работе праймеров и условия ПЦР
Ген Последовательности праймеров (прямой и обратный) Длина продукта Число циклов Температура отжига Ссылка
GAPDH 5' -TCCATGACAACTTTGGCATTGTGG-3' 376 пн 29 66°C [28]
5' -GTTGCTGTTGAAGTCGCAGGAGAC-3'
VEGF 5' -TGCACCCACGACAGAAGGGGA-3' 567 пн 36 68°C [15]
5' -TCACCGCCTTGGCTTGTCACA-3' 495 пн
435 пн
363 пн
MC4R 5' -AGTCTCTGGGGAAGGGGCA-3' 422 пн 38 64°C [29]
5' -CAACTGATGATGATCCCGAC-3'
экспрессии гена GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа).
Статистическая обработка результатов.
Достоверности различий групповых средних оценивались с помощью дисперсионного анализа (oneway ANO
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.