НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 3, с. 208-215
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8.015:576.345
АЛЬФА-ТОКОФЕРОЛ В НАНОМОЛЯРНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ ПОВЫШАЕТ ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ КЛЕТОК РС12 ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ, РОЛЬ МОДУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ СИГНАЛЬНЫХ СИСТЕМ © 2011 г. Т. В. Соколова, М. П. Рычкова, И. О. Захарова, И. В. Войнова, Н. Ф. Аврова*
Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН,
Санкт-Петербург, Россия
Получены свидетельства того, что при длительном воздействии на клетки нейрональной линии РС12 (преинкубация в течение 3—18 ч) а-токоферол не только в микро-, но и в наномолярных концентрациях достоверно повышает жизнеспособность клеток в условиях окислительного стресса. Впервые показано, что защитный эффект альфа-токоферола тем выше, чем выше его концентрация в диапазоне 1—100 нМ, а его эффекты в концентрации 100 нМ,1, 10 и 100 мкМ не различаются между собой, если преинкубация с ним велась в течение 12—18 ч до действия Н2О2. Важную роль в реализации защитного эффекта а-токоферола в разных концентрациях при длительных сроках преин-кубации играет, очевидно, модуляция им активности протеинкиназы С, протеинкиназы, активируемой внеклеточными сигналами и фосфатидилинозит 3-киназы. При краткой преинкубации (0.5 и 1.5 ч) клеток РС12 с этим антиоксидантом а-токоферол в наномолярных концентрациях практически не влияет на жизнеспособность клеток, а защитный эффект а-токоферола в микромолярных концентрациях связан, очевидно, с его способностью прерывать свободнорадикальные цепи, непосредственно реагируя со свободными радикалами
Ключевые слова: а-токоферол, наномолярные концентрации, защитный эффект, клетки РС12, окислительный стресс, сигнальные системы.
Жизнеспособность нервных клеток и клеток нейрональных линий в культуре, подвергнутых действию токсинов, активирующих свободноради-кальные реакции, повышается в присутствии а-токоферола и других компонентов витамина Е, причем именно а-токоферол в наибольшей мере накапливается в тканях организма животных, для него характерна и наибольшая антиоксидантная активность [1—3]. Показана нормализация метаболизма нейронов мозга и повышении их жизнеспособности компонентами витамина Е у животных с различными формами поражения центральной нервной системы [см., например, 4—6].
В последние годы представления о механизме защитного действия а-токоферола и других компонентов витамина Е существенно изменились. Ранее превалировало мнение, согласно которому повышение жизнеспособности клеток при действии на них компонентов витамина Е связано прежде всего с их способностью прерывать свободнорадикаль-ные цепи в липидной фазе и снижать таким образом интенсивность окислительного стресса в клетках. В последние годы получены новые данные о том, что
* Адресат для корреспонденции: Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 33; тел.: (812) 552 8035; факс: (812) 552 3012; e-mail: avrova@iephb.ru.
модуляция этими соединениями активности сигнальных систем играет важную роль в повышении ими жизнеспособности клеток [1, 4, 7]. К результатам, способствовавшим пересмотру представлений, относятся и данные о влиянии а-токоферола на интенсивность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в организме животных in vivo, полученные при определении содержания изопростанов и ней-ропростанов. Для нервной ткани они оказались неожиданными. Найдено, что при длительном дефиците а-токоферола в пище и снижении его содержания в ткани мозга интенсивность ПОЛ в мозге не только не усиливается, но, напротив, снижается [8]. В других работах не наблюдалось изменения интенсивности процессов ПОЛ и уровня глутатиона в мозгу животных, получавших диету с дефицитом или избытком витамина Е по сравнению с контролями [9, 10]. Это трудно объяснить, если защитное действие а-токоферола определяется прежде всего его способностью прерывать свободнорадикальные цепи, взаимодействуя со свободными радикалами. Кроме того, обнаружение а-токоферилфосфата в качестве природного соединения в органах животных [11, 12] позволяет надеяться, что биоактивные липиды пополнятся парой а-токоферол—а-токо-ферилфосфат [12]. Немаловажны и результаты клинических испытаний витамина Е, который давали
десяткам тысяч людей в группах риска или с различными болезнями. При их обобщении оказалось, что у людей, получавших витамин Е, смертность от разных причин достоверно выше, чем у людей, получавших плацебо [13, 14]. Найдено, что при действии на изолированные клеточные мембраны способность а-токоферола увеличивать микровязкость и упорядоченность мембран, ингибировать активность протеинкиназы С, воздействовать на перок-сидное окисление имеет два (или более) максимума активности, один из которых находится в области его сверхмалых концентраций [15—17]. Все эти данные показывают, что а-токоферол обладает сложными эффектами при действии на клеточные мембраны и клетки.
Для понимания механизма действия антиокси-дантов в организме человека и животных необходимо изучение эффектов на клетки их физиологических концентраций. В спинномозговой жидкости (СМЖ) и межклеточном пространстве мозга физиологическими концентрациями а-токоферола являются его наномолярные концентрации [18—20]. Но пока данные об эффектах а-токоферола в нано-молярных концентрациях единичны и противоречивы, в двух работах не удалось показать его защитного эффекта [2, 21]. А в работе Нумакава и соавторов [22] найдено, что 10 и 100 нМ а-токоферола повышают жизнеспособность нейронов коры мозга крыс при окислительном стресса, но не показано в каком диапазоне этот эффект зависит от концентрации а-токоферола.
Цель работы — изучение защитного действия а-токоферола в наномолярных концентрациях на клетки нейрональной линии РС12, подвергнутые действию Н2О2, выявление зависимости его защитной активности от концентрации при разных сроках преинкубации с ним. В цели исследования входит также изучение механизма действия а-токоферола, вклада модуляции активности протеинкиназы С, протеинкиназы, регулируемой внеклеточными сигналами (ERK 1/2), и фосфатидилинзит 3-киназы (PI 3-киназы) в повышение а-токоферолом жизнеспособности клеток РС12 при окислительном стрессе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы. В опытах использовали Н2О2, NADH, диметилсульфоксид и пируват фирмы Sigma (США), ингибиторы ERK 1/2, PI 3-киназы и протеинкиназы С (SL327, LY294002 и GF109203X) фирмы Calbiochem (США), пенициллин и стрептомицин фирмы Serva (Германия). Среда инкубации DMEM с L-глутамином, сыворотка крови лошади и плодов коровы куплены у фирмы Биолот (Россия).
Условия культивирования клеток. Опыты проводили на культуре клеток линии РС12 в инкубаторе при 5% СО2. Клетки РС12 были любезно предостав-
лены нам проф. Мюллером из Университета г. Франкфурта (Германия). Клетки выращивали в среде DMEM с L-глутамином, содержащей 10% сыворотки крови плодов коровы и 5% сыворотки крови лошади, 25 мкг/мл пенициллина и 25 ед/мл стрептомицина. Среду меняли каждые 2—3 дня. Для проведения опытов клетки РС12 переносили в 24-луночные планшеты, количество клеток в лунке составляло 2 х 105.
Опыты начинали через 24 ч после посева клеток в планшеты. К ним добавляли свежую среду и инкубировали при 37°С в течение 0.5 ч с ингибиторами (или без них), затем в течение 0.5, 1.5, 3, 6, 12 или 18 ч с а-токоферолом (или без него). Затем добавляли H2O2 до конечной концентрации 0.2 мМ и инкубировали с ней в течение 24 ч, либо добавляли H2O2 до концентрации 1 мМ и инкубировали в течение 3 ч.
Определение жизнеспособности клеток проводили по активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ), вышедшей из клеток в среду после воздействия H2O2. Чтобы исключить попадание отдельных неприкрепленных клеток в надосадочную жидкость, пробы центрифугировали в течение 5 мин при 270 g. Полный лизис клеток проводили, инкубируя их 30 мин с Тритоном Х-100 в конечной концентрации 1% при комнатной температуре, затем определяли общую активность фермента в пробах.
Об активности ЛДГ судили по изменению уровня NADH, который измеряли по уменьшению оптической плотности при 340 nm на спектрофотометре Specord М40 (Karl Zeisse, Германия) в течение 5—6 мин, как это описано в работе [23]. Реакцию проводили в среде следующего состава: 80 мМ Трис-НС1, рН 7.2, 200 мМ NaCl, 1.6 мМ пируват, 0.2 мМ NADH. Определяли процент активности ЛДГ в среде от суммарной активности ЛДГ в пробах (в клетках и среде). Ноль процентов жизнеспособности клеток соответствует 100% активности ЛДГ в среде. а-Токоферол растворяли в ДМСО или этиловом спирте. К пробам, не содержащим а-токоферол, добавляли равную аликвоту растворителя.
Данные представлены как M ± S.E.M. Статистическую достоверность различий между тремя и более группами данных определяли на основании од-нофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) c использованием Tukey's post hoc теста для множественных сравнений. При сравнении двух групп данных применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали достоверными прир < 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цитотоксическое действие Н2О2 на клетки РС12 определяли по вызванному ею высвобождению ЛДГ из разрушенных клеток, защитный эффект а-токоферола оценивали по его способности снижать вызванный Н2О2 выход ЛДГ из клеток и соответственно повышать их жизнеспособность. Най-
35
30
25
1-4
П
Л20
д
о
й 3
В
В15
10
* x#
ri
* xx
* ##
il
40
35
30 * 25 h
l-ч
П
Ч 20 I-
д
о
з 15 h В
101-
5 Ь
0
xx
* x#
* ##
*
xx#
а
*
*
*
5
6
6
1
2
3
4
5
7
1
2
3
4
5
7
8
Рис. 1. Влияние перекиси водорода и различных концентраций а-токоферола (а-Т) на жизнеспособность клеток РС12 при краткой преинкубации с ним (% ЛДГ в среде инкубации от суммарной активности в пробах). Данные представлены как M ± S.E.M из 2—3 параллельных определений одного типичного опыта из 4 поставленных опытов. а — преинкубация с а-токоферолом в течение 0.5 ч, б — в течение 1.5 ч. a. 1 — контроль, 2 — Н2О2, 3 — Н2О2 + 100 мкМ а-Т, 4 - Н2О2 + 10 мкМ а-Т, 5 - Н2О2 + 1 мкМ а-Т, 6 - Н2О2 + 100 нМ а-Т, 7 - Н2О2 + 10 нМ а-Т. 1 - контроль, 2 - контроль+100 мкМ а-Т, 3 - Н2О2, 4 - Н2О2 + 100 мкМ а-Т, 5 - Н2О2 + 10 мкМ а-Т, 6 - Н2О2 + 1 мкМ а-Т, 7
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.