МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 3, с. 368-375
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.842.11.053+575.117.2
ALIIVIBRIO LOGEI KCh1 (ИЗОЛЯТ КАМЧАТКА): БИОХИМИЧЕСКИЕ И ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ, КЛОНИРОВАНИЕ /ш>ОПЕРОНА © 2010 г. С. А. Хрульнова*, И. В. Манухов*, А. П. Зарубина**, Г. Б. Завильгельский*,1
*ФГУПГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва **МГУим. М.В. Ломоносова, биологический факультет, кафедра микробиологии Поступила в редакцию 01.07.2009 г.
Изолирован новый штамм светящихся морских бактерий рода Aliivibrio (ранее Vibrio) из кишечника бычка Cottida sp. (акватория Охотского моря, Камчатка, штамм маркирован как KChl). Определены основные условия роста штамма на лабораторных средах. Показано, что штамм KChl относится к группе психрофильных бактерий: оптимальная температура роста около 15°С. Определена нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и показано, что она практически идентична последовательности 16S рРНК Aliivibrio logei и A. salmonicida, но значительно отличается от таковой A. fischeri. Биохимические признаки (редукция нитрата, декарбоксилирование лизина, ферментация ^-галактозы) штамма KChl совпадают с таковыми штаммов A. logei и A. fischeri. Определена антибиотикограмма штамма KChl. Клонирован lux-оперон KChl в клетках Escherichia coli, и определена частично его нуклеотидная последовательность, которая обнаруживает высокую гомологию с lux-опероном бактерий A. salmonicida.
Ключевые слова: Aliivibrio logei, биолюминесценция, lux-оперон.
Впервые светящиеся морские бактерии Aliivibrio logei подробно охарактеризованы и выделены в особый вид рода Vibrio (ныне Aliivibrio [1]) в 1978 г [2]. Ранее предполагалось, что эти бактерии относятся к особому психрофильному подвиду A.. fischeri, представители которого растут при 4°С и не растут при 30°С, в отличие от стандартных штаммов A. fischeri, которые, напротив, не растут при 4°С и растут при 30°С. Позднее было показано, что бактерии A. logei, как и бактерии A. fischeri, являются симбионтами кальмаров, однако, в отличие от A. fischeri, которые заселяют световые органы (фотофоры) в основном кальмаров рода Euprymna, обитающих в жарких водах районов Гавайских островов и западной части Тихого океана, обнаруживаются исключительно в световых органах кальмаров рода Sepiola, обитающих в более глубоких и холодных водах Атлантики [3]. В этой же работе было показано, что по ряду биохимических признаков (декабоксилирование лизина, восстановление нитрата, а также ферментация ^-галактозы) бактерии A. logei схожи с бактериями A. fischeri и при этом принципиально отличаются от бактерий, принадлежащих к родственному, но патогенному для атлантического лосося виду A. salmonicida. Однако сравнительный анализ вариабельного фрагмента 16S рРНК данных видов бактерий показал их идентичность у A. logei c A. salmonicida и значительные различия этих фрагментов у A. logei и A. fis-cheri [3].
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: zavilgel@genetika.ru).
В настоящей работе проведено исследование штамма светящихся морских бактерий КСЫ, изолированного из кишечника бычка СоШйа 8р. (акватория Охотского моря, Камчатка).
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Бактериальные штаммы и плазмиды. В работе использовали бактерии Escherichia coli TG-1 F— thi hsdA5, supE, A(lac-pro)/F(traD36 proAB+ lacIqZ-M15); E. coli МС1061 F araD139 A(ara leu)769 lacX74 galU galK hsdR mcrB rpsL thi.
Штаммы A. fischeri MJ-1 и МГУ-6 были получены из коллекции кафедры микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Были также использованы гибридная плазмида pVFR1 — вектор pBR322, содержащий фрагмент ДНК с геном luxR и регуляторной областью lux-опе-рона A. fischeri, встроенный перед кассетой с генами luxCDABE Photorhabdus luminescens, используемыми в качестве генов-репортеров [4], вектор pUC19.
Культивирование. Морские люминесцирующие бактерии растили на среде SWTm, содержащей (%, в./об.): 0.5 триптона, 0.25 дрожжевого экстракта, 1.5 морской соли и 0.3 глицерина. Бактерии E. coli растили в бульоне Луриа-Бертани (LB). Агаризо-ванные среды готовили с 1.5% агаром. Штаммы с плазмидами растили на средах, содержащих 100 мкг/мл ампициллина.
Ферменты и химические вещества. В работе использовали ферменты фирмы "Fermentas" (Литва), а также N-3-оксогексаноил-лактон Z-гомосерина, используемый в качестве аутоиндуктора (АИ), и субстрат люциферазы — я-деканаль ("Sigma").
Для биохимического тестирования штаммов использовали "Набор № 2 СИБ — для межродовой и межвидовой дифференциации энтеробактерий" (13 тестов).
Биохимическое тестирование. Для определения качественной реакции восстановления нитратов бактерии растили в жидкой среде, содержащей 0.5% пептона и 0.2% нитрата калия. После суточного инкубирования при температуре 20°С в суспензию добавляли 0.5 мл 0.8% раствора сульфаниловой кислоты в 5 Н уксусной кислоте и 9.5 мл 0.6% раствора а-нафтиламина в 5 Н уксусной кислоте (реактив Грисса). Появление красной окраски указывает на образование нитрита.
Измерение антибиотикограмм. Антибиотико-граммы определяли стандартным методом, располагая диски на поверхности агара с высеянной свежей тест-культурой.
Выделение ДНК. Выделение гибридных плазмид и векторов проводили методом щелочной экстракции. Хромосомную ДНК A. logei выделяли из клеток поздней логарифмической фазы роста, обрабатывая клетки лизоцимом и SDS с последующей обработкой фенолом и переосаждением в этаноле.
Рестрикцию и лигирование фрагментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля методом электроэлю-ции и трансформацию кальциевых клеток проводили согласно [5].
Клонирование генов /их-оперона. Для конструирования плазмиды pSV1, содержащей 1их-оперон A. logei, хромосомальную ДНК рестрицировали по сайтам MboI (с получением недорестрикта) и клонировали в вектор pUC19 по сайту BamHI. Для
Таблица 1. Рост бактерий штаммов КСЫ, А. ^ег, А./гз-скеп, А. salmonicida в зависимости от температуры культивирования
Температура культивирования
Штамм 4°С 30 °С Оптимальная температура, °C
KChl + - 15
A. fischeri MJ-1 - + 25
A. fischeri МГУ-6 - + 25
A. logei* + - 15
A. salmonicida + - 15
"+" — положительно, "—" — отрицательно. *Данные для A. logei и A. salmonicida взяты из [3].
конструирования плазмиды pSV2 хромосомальную ДНК A. logei и вектор pUC19 рестрицировали по сайтам HindIII (рис. 1).
HindIII-, $йгоШ-фрагменты ДНК KChl разделяли в агарозном геле, полосу размером 5—10 т.п.н. элюировали из геля и лигировали в вектор pUC19. Трансформированные клетки E. coli MC1061 высевали на агаризованную среду с ампициллином (150 мкг/мл), светящиеся клоны отбирали визуально (в варианте с n-деканалем — раствор n-деканаля наносили на крышку чашки Петри). Из примерно 2000 клонов был отобран один клон, люминесциру-ющий в отсутствие n-деканаля, и три клона, люми-несцирующие лишь при наличии на чашках n-дека-наля.
Определение нуклеотидной последовательности 16S рРНК и /их-оперона. Секвенирование ДНК проводили с помощью дидезоксинуклеотидтри-фосфатов согласно Сэнгеру и др. [6].
Для ПЦР амплификации и секвенирования 16S рДНК использовали следующие праймеры:
REV16S salm 5'-AGCCGGTTTTGTTTCTGCCCTC-3' Dir16S salm 5'-CAACCTTGGCAATCTGTGTGAACA-3' Lux16SD 5'-CGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATG-3' Lux15SR 5'-TGCAGCCCACTCCCATGGTGTGAC-3'
Биолюминесценцию клеток, содержащих гибридные плазмиды, измеряли на люминометре, состоящем из фотоумножителя ФЭУ-85 и микровольтметра В2-15. Интенсивность биолюминесценции (I) измеряли в специальных кюветах, содержащих 200 мкл препарата, при комнатной температуре. При необходимости к суспензии клеток перед измерением люминесценции добавляли 2—3 мкл субстрата люциферазы — 0.001%-ного спиртового раствора я-деканаля ("Sigma").
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оптимальная температура роста
Как видно из данных, представленных в табл. 1, бактерии штамма КСЫ являются психро-филами, так как способны расти при 4°С и не способны расти при 30°С (оптимальная температура роста 15°С), в отличие от бактерий вида А. рз-скеп, которые, напротив, хорошо растут при 30°С и не растут при 4°С.
100000 Г
я
и tf
х
(D tf
О
и
X
и
%
2 Л
10000
1000 -
1000
100000 Г
^ 10000
я
и
X
<D
я
о
и
х
и
%
2 Л
1000
100
10
50
100
Время, мин (б)
150
200
10 15
20 25 30 Время, мин
35 40 45
50
2
1
0
1
0
5
Рис. 1. Участие системы "quorum sensing" в индукции биолюминесценции в клетках штамма KCh1: а — влияние АИ на индукцию биолюминесценции в клетках штамма KCh1. Клетки KCh1 растили в SWTm при 11°C до OD = 0.1—0.2, образец делили пополам и в опытную пробу добавляли АИ (N-3-оксогексаноиллактон Z-гомосерина) в конечной концентрации 10-6 М или надосадочную жидкость (получена в результате центрифугирования стационарной культуры KCh1). Пробы инкубировали при 11 °С без перемешивания и через равные интервалы времени отбирали по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. По оси ординат отложена интенсивность биолюминесценции (I) в относительных единицах. По оси абсцисс отложено время в минутах. 1 — клетки без добавления (контроль); 2 — клетки с добавлением надосадочной жидкости; 3 — клетки с добавлением АИ, 10-6 М. б — Влияние надосадочной жидкости (получена в результате центрифугирования и фильтрования через фильтр (0.22 мкМ) стационарной культуры KCh1 на индукцию биолюминесценции в клетках E. coli MC1061 (pVFR1). Клетки E. coli MC1061 (pVFR1) росли при 37°C до OD = 0.3—0.4. Пробы инкубировали при 30°С без перемешивания, через каждые 10 мин отбирали по 200 мкл и измеряли интенсивность биолюминесценции. По оси ординат отложена интенсивность биолюминесценции (I) в относительных единицах. По оси абсцисс отложено время в минутах. 1 — клетки без добавок (контроль); 2 — клетки с добавлением надосадочной жидкости; 3 — клетки с добавлением АИ, 10-6 М.
Данные по 16БрРНК
Проведено секвенирование гена, кодирующего 168 рРНК штамма КСЫ. Как видно из данных, представленных в табл. 2, нуклеотидная последовательность гена 168 рРНК штамма КСЫ значительно отличается от таковой у бактерий А. АзсНвп (в среднем имеется примерно 65 различий; в
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.