научная статья по теме АМПЛИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА И ВИРУСА КОЛЬЦЕВОЙ ГРАВИРОВКИ ГВОЗДИКИ Биология

Текст научной статьи на тему «АМПЛИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА И ВИРУСА КОЛЬЦЕВОЙ ГРАВИРОВКИ ГВОЗДИКИ»

ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 12, с. 1682-1684

УДК 577.214.625:578.853

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ

АМПЛИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ВИРУСА МОЗАИКИ ГЕОРГИНА И ВИРУСА КОЛЬЦЕВОЙ ГРАВИРОВКИ ГВОЗДИКИ

© 2007 г. Б. Р. Кулуев1, А. В. Чемерис2

1 Башкирский государственный университет, кафедра биохимии и биотехнологии, Уфа 450074;

e-mail: Kuluev@bk.ru

2 Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук, Уфа 450054

Поступила в редакцию 10.11.2006 г.

Впервые был амплифицирован и клонирован промотор вируса мозаики георгина. Секвенирование показало наличие гомологии данного промотора с промоторами других каулимовирусов. Также был амплифицирован и клонирован промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики.

В трансгенных растениях для проявления достаточного уровня экспрессии чужеродного гена вместо собственных промоторов этих генов часто применяют сильные, конститутивные промоторы каулимовирусов. Наиболее известным является промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (ВМЦК) [1]. Этот промотор оказался более сильным, чем промоторы маннопинсинтазы и ок-топинсинтазы, широко применявшиеся ранее в генной инженерии растений. Тем не менее для некоторых целей сила промотора 35S РНК оказалась недостаточной [2]. В этой связи представляет значительный интерес поиск новых более сильных промоторов. Поскольку промотор 35S РНК ВМЦК оказался во многом универсальным, стал осуществляться поиск аналогичных промоторов других каулимовирусов. Так как георгин и гвоздика поражаются каулимовирусами, первоначально были отобраны растения с характерными симптомами вирусных заболеваний. Промотор вируса кольцевой гравировки гвоздики был амплифицирован из листьев различных видов гвоздик, присланных из Института вирусологии, микробиологии и биологической безопасности (г. Брауншвейг, Германия). В Уфе были обнаружены растения георгина, листья которых имели характерную мозаику и которые были использованы в работе. Молекулярно-биологическими методами было показано, что листья поражены вирусом мозаики георгина (ВМГ).

Амплификация и клонирование промотора вируса мозаики георгина. Вирус мозаики георгина вызывает образование просветлений в области жилок, в природе инфицирует только представителей рода Dahlia (георгин). Геном вируса георгина секвенирован частично, в Генбанке

представлены только последовательности отдельных генов ^203678, AY291585, AY971810). Промотор и околопромоторная область не секве-нированы, что не позволяет подобрать удобные праймеры для амплификации промотора ВМГ. В связи с этим при подборе праймеров использовали известные последовательности генома ВМГ и подбирали участки, близко прилегающие к промотору. Наиболее подходящими оказались праймеры 5'-CAGTGACTCATCCTCCAATA-3' и 5'-AATATCГACTGACATTTCГT-3\ Теоретические расчеты показали, что размер амплифици-руемого участка должен был составить около 1300 пн. Амплификацию проводили при температуре отжига 48°С при добавлении в реакционную смесь DMSO (диметилсульфоксид) до концентрации 1%. Размер амплифицируемого участка составил приблизительно 1300 пн. Этот фрагмент ДНК был клонирован в фагмидный вектор рКЯХ и секвенирован (EF463101). Анализ последовательности показал, что была клонирована последовательность, включающая часть гена 6, промотор, большой межгенный спейсер и 7-ю открытую рамку считывания вируса мозаики георгина. Выравнивание секвенированной последовательности промоторного участка с известной последовательностью гена 6 вируса мозаики георгина из Генбанка с помощью программы "MegaHgn" пакета Lasergene показало совпадение последовательностей. Таким образом, нам впервые удалось секвенировать промотор вируса мозаики георгина и провести его первичный анализ. Промотор ВМГ оказался гомологичным промоторам других каулимовирусов. Например, гомология промотора ВМГ с промотором вируса мозаики норичника составила 60% [3], а гомология с промотором вируса мозаики ночной красавицы - 63% [4]. Срав-

1682

АМПЛИФИКАЦИЯ И КЛОНИРОВАНИЕ ПРОМОТОРОВ ВИРУСА

1683

нительный анализ регуляторных областей промоторов ВМГ, вирусов мозаики норичника и ночной красавицы показал следующее: ССАСТ-бокс у вируса норичника имеет каноническую последовательность, у ВМГ она представлена последовательностью ССААТ, у вируса ночной красавицы -GCAAC; у вирусов норичника и ночной красавицы TGACG-бокс представлен последовательностью TGACG, а у ВМГ Т заменен на А; ТАТА-бокс у всех трех видов не различается и представляет собой консенсусную последовательность ТАТАТАА. Проведенный анализ позволил оценить расположение и подобрать праймеры для амплификации самого промотора, размер которого, судя по гомологии с родственными каулимовирусами, не должен превышать 400 пн. В итоге был амплифи-цирован и клонирован промоторный участок генома вируса мозаики георгина размером 442 пн, зарегистрированный в Генбанке под номером EF513491. Этот промотор был клонирован в бинарный вектор pCambia 1304 [http://www.cam-bia.org.au], в котором контролировал экспрессию репортерных генов uidA и gfp. Показано, что промоторный участок генома ВМГ проявляет свою активность в клетках Escherichia coli, Agrobacteri-um tumefaciens и в протопластах табака.

Амплификация и клонирование промотора вируса кольцевой гравировки гвоздики. В Ген-банке есть полная последовательность генома вируса кольцевой гравировки гвоздики. Путем множественного выравнивания с различными каулимовирусами было выявлено, что этот вирус стоит ближе к ВМЦК, чем к другим вирусам. Поэтому для оценки расположения промотора провели выравнивание генома ВКГГ с геномами четырех штаммов ВМЦК. Далее, учитывая выравнивание со всеми каулимовирусами, осуществили подбор праймеров для амплификации промотора ВКГГ, при этом отдавали преимущество более консервативным участкам. Было подобрано три праймера: CERVFltFl 5'-ATTAAAAGAACAATGGCAAG-3', CERVFltF2 5'-AGAAGATTTAATGGCAATCC-3', CERVFltR 5'-AGGACTTAGGCTCAACACAT-3'. При амплификации с праймерами CERVFltFl и CERVFltR размер ампликона должен составить 651 пн, а с праймерами CERVFltF2 и CERVFltR -501 пн. Из четырех образцов листьев гвоздики нам удалось амплифицировать ДНК размерами около 500 и 650 пн. Проведенные исследования позволили показать наличие ВКГГ в листьях гвоздики. Далее оба фрагмента ДНК, отличающиеся лишь расположением праймеров, были клонированы в фагмидных векторах pKRX и pBluescript II KS (+/-) и проведено секвенирование

фрагментов. Последовательность промоторного участка размером 455 пн была зарегистрирована в Генбанке под номером EF513492. Поиск сходных последовательностей в базе данных генов c помощью программы "Megablast", доступной на вебсайте NCBI, показал 95%-ную гомологию се-квенированного нами промотора с промоторным участком изолята вируса ВКГГ из США. Путем множественных выравниваний промоторов кау-лимовирусов показано, что промотор ВКГГ стоит ближе всего к промотору 35S РНК ВМЦК. Сравнительный анализ последовательностей промоторов вируса мозаики цветной капусты и вируса кольцевой гравировки гвоздики показал, что ССАСТ-бокс у промотора ВКГГ отличается от такового промотора 35S РНК ВМЦК и представлен последовательностью СТАСТ; ТАТА-бокс представлен последовательностью ТАТАТАА, TGACG-бокс - канонической последовательностью TGACG, так же как и у промотора 35S РНК ВМЦК. Благодаря выравниванию нуклеотидной последовательности промотора ВКГГ с промоторами других каулимовирусов стали известны как точные расположения основных доменов, так и границы самого промотора. Промотор ВКГГ начинается с 6750-го нуклеотида и заканчивается 7102-м. Таким образом, его размер составляет 352 пн. Гипотетически можно предположить, что это его оптимальный размер, при котором проявляется экспрессионная сила. Для определения активности данного промотора нами сконструированы плазмиды на основе бинарных векторов семейства pCambia, в которых промотор ВКГГ контролирует экспрессию репортерных генов gfp и uidA. Показана активность промотора в клетках Escherichia coli, Agrobacterium tumefaciens, в протопластах и проростках табака.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Odell J.T., Nagy F., Chua N.H. Identification of DNA sequences required for activity of the cauliflower mosaic virus 35S promoter // Nature. 1985. V. 313. № 6005. P. 810-812.

2. Mitsuhara I, Ugaki M, Hirochika H. et al. Efficient promoter cassettes for enhanced expression of foreign genes in dicotyledonous and monocotyledonous plants // Plant Cell Physiol. 1996. V. 37. № 1. P. 49-59.

3. RichinsR.D., Scholthof HB, ShepherdR.J. Sequence of figwort mosaic virus DNA // Nucl. Acids Res. 1987. V. 15. № 20. P. 8451-8465.

4. Dey N, Maiti IB. Structure and promoter/leader deletion analysis of mirabilis mosaic virus (MMV) full-length transcript promoter in transgenic plants // Plant Mol. Biol. 1999. V. 40. № 5. P. 771-782.

ГЕНЕТИКА том 43 < 12 2007

7*

1684

КУЛУЕВ, ЧЕМЕРИС

Amplification and Cloning of Dahlia Mosaic Virus and Carnation Etched Ring Virus Promoters

B. R. Kuluev1 and A. V. Chemeris2

1 Department of Biochemistry and Biotechnology, Bashkir State University Ufa, 450074 Russia;

e-mail: Kuluev@bk.ru 2 Institute of Biochemistry and Genetics, Ufa Research Center, Russian Academy of Sciences, Ufa, 450054 Russia

Amplification and cloning of dahlia mosaic virus promoter were carried out for the first time. Sequence analysis showed homology between this promoter and the promoters of other caulimoviruses. In addition, amplification and cloning of the carnation etched ring virus promoter was performed.

ГЕНЕТИКА том 43

< 12 2007

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком