ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 51, № 2, с. 206-212
УДК 579.6
АНАЭРОБНЫЕ БАКТЕРИИ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ДЕГРАДАЦИИ АРОМАТИЧЕСКИХ СУЛЬФОНАТОВ ДО МЕТАНА
© 2015 г. В. А. Щербакова, К. С. Лауринавичюс, Н. А. Чувильская, Я. В. Рыжманова, В. К. Акименко
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино, Московская обл., 142290
e-mail: shcherb@ibpm.pushchino.ru Поступила в редакцию 22.05.2014 г.
Получен анаэробный консорциум микроорганизмов, разрушающий бензол- и п-толуолсульфонаты с образованием метана и жирных кислот. Выделены в чистые культуры и охарактеризованы три штамма анаэробных спорообразующих бактерий Clostridium spp., а также сульфатвосстанавливаю-щая бактерия Desulfovibrio sp. Филогенетический анализ полученных последовательностей генов 16S рРНК штаммов показал, что чистые культуры штаммов клостридий 14, 24 и 21 близки Clostridium lituseburense DSM 797T, C. sartagoforme DSM 1292T и C. pascui DSM 10365T, а сульфатредуцирую-щий штамм SR1 генотипически наиболее близок Desulfovibrio aminophilus ALA-3T. Предварительная характеристика выделенных бактерий позволяет предположить, что это новые виды родов Clostridi-um и Desulfovibrio, отличительной особенностью которых является способность включать в свой метаболизм ароматические сульфонаты.
Ключевые слова: анаэробный консорциум, ароматические сульфонаты, бактерии родов Clostridium, Desulfovibrio, бензол- и п-толуолсульфонаты.
DOI: 10.7868/S0555109915020191
Исследования последних лет показали, что трансформация ароматических соединений, представляющих реальную угрозу для здоровья людей даже в минимальных концентрациях, может успешно осуществляться не только в аэробных, но и в анаэробных условиях [1]. В течение двух десятилетий непрерывно совершенствуются и развиваются анаэробные технологии, использующие биореактор UASB типа с восходящим потоком жидкости через слой анаэробного ила в виде гранул, сформированных активным сообществом микроорганизмов, разрушающим пол-лютанты с образованием метана [2]. Однако разработка и применение анаэробных технологий для очистки сточных вод, содержащих ароматические соединения, сдерживается отсутствием сведений о микроорганизмах, трансформирующих подобные соединения в условиях, способствующих метаногенезу, и о закономерностях протекания этого процесса. Нами был получен консорциум микроорганизмов, разрушающий бензол- и п-толуолсульфонаты, из которого были выделены в чистые культуры и частично охарактеризованы три штамма Clostridium sp., два метаногена, а также сульфатвосстанавливающая бактерия (СВБ) Desulfovibrio sp. [3, 4].
Цель работы — исследование физиолого-био-химических и филогенетических характеристик штаммов первичных и вторичных анаэробов,
участвующих в процессе разрушения низших гомологов алкилбензолсульфонатов с образованием метана.
МЕТОДИКА
Получение анаэробного консорциума анаэробных микроорганизмов. Гранулы иА8В реактора, работающего на сточных водах целлюлозобумаж-ного производства (г. Сыктывкар), разрушали путем продавливания суспензии гранул через иглу с медицинского шприца и инокулировали в 125 мл флаконы, содержащие 50 мл среды РВВМ следующего состава (г/л): К2НР04 - 0.29; КН2Р04 - 0.29; ШС1 - 1.0; М§С12 ■ 6Н20 - 0.2; МН4С1 - 1.0; СаС12 -0.1; цистеин-гидрохлорид - 0.5; раствор витаминов [5] - 5 мл; раствор микроэлементов [5] - 10 мл; бензолсульфонат (БС) или п-толуолсульфонат (ТС) - 0.4; дрожжевой экстракт - 1.0. Флаконы инкубировали в анаэробных условиях при температуре 29 или 37°С. Ассоциат считали стабильным после восьми пересевов с полной утилизацией ароматических сульфонатов.
Культивирование бактерий. Чистые культуры бактерий поддерживали и культивировали, соблюдая приемы и методы техники анаэробного культивирования [6]. Для поддержания чистых культур и получения биомассы клостридий ис-
пользовали среду, содержащую (г/л): NH4Cl — 1.0; K2HPO4 - 0.4; MgCl2 ■ 6H2O - 0.1; цистеин-гидро-хлорид — 0.5; Na2S ■ 9Н20 — 0.5; раствор микроэлементов [5] — 10 мл; дрожжевой экстракт — 5.0; бактотриптон — 2.0; резазурин — 0.002; и ТС — 0.2—0.4. Для штамма 24 в состав среды дополнительно включали глюкозу (5.0 г/л), для штамма 14 — гистидин (2 г/л) а для штамма 21 — глюкозу и толуол (0.5 мл/л). СВБ штамм SR1 культивировали на среде Виделя и Пфеннига [7] с лактатом (4 г/л) в качестве донора электронов. Все выделенные штаммы 14, 24, 21 и SR1 помещены во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов (ВКМ) под номерами B-2201, B-2202, B-2279 и B-2200, соответственно.
Морфологию клеток изучали в фазовом контрасте на световом микроскопе Opton ICM 405 (Германия) при увеличении 100 х 3.2. Физиологические особенности изолятов изучали по общепринятым методикам [8—9].
Определение десульфовиридина проводили по методике Постгейта [9], а сульфида — колориметрически [10].
Жирные кислоты и содержание метана в газовой фазе определяли на газовом хроматографе Pye-Unicam 304 (Великобритания) как описано ранее [3]. Бензолсульфонат натрия (БС), п-толу-олсульфонат натрия (ТС) и толуол анализировали методом обратно-фазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Для этого образцы культуральной жидкости объемом 0.5 мл центрифугировали при 8000 g в течение 5 мин и суперна-тант анализировали в изократическом режиме на жидкостном хроматографе высокого давления производства "Laboratorne Pristroje" (Чехия) с использованием стеклянной колонки длиной 15 см, заполненной Сепаролом SGXC С18 (7 мкм) фирмы "Tessek" (Чехия). При определении БС и ТС подвижная фаза состояла из фосфатного буфера (рН 6,7) и метанола в соотношении 85 : 15, а при определении толуола — из ацетонитрила, н-бутано-ла и воды в соотношении 52 : 8 : 40. Скорость подачи подвижной фазы составляла 1.5 и 1.0 мл/мин соответственно. Анализируемые соединения детектировали при 254 нм.
Определение нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Выделение ДНК из биомассы бактерий проводили по методике, описанной ранее [11]. Для амплификации фрагмента генов 16S рРНК использовали универсальные прайме-ры 27F, 1429R и 515-533F. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на амплификаторе Терцик ("ДНК-Технологии", Россия). Для получения ПЦР-фрагментов применяли следующий температурно-временной режим: начальная денатурация — 94°C, 3 мин; последующие 30 циклов — 94°C — 20 с, 55°C — 10 с, 72°C — 1 мин 30 с; конечная полимеризация — 72° C — 3 мин. Реак-
мМ
сут
Рис. 1. Образование метана из п-толуолсульфоната
анаэробной ассоциацией микроорганизмов (мМ):
1 — метан, 2 — БС, 3 — ТС, 4 — толуол.
ционная смесь (25 мкл) содержала: 1 х буфер для Taq-полимеразы (Fermentas, Литва), 10—50 нг ДНК-матрицы, по 50 мкмоль каждого дезоксири-бонуклеотидтрифосфата (dNTP) ("Fermentas", Литва), по 10 пмоль соответствующих праймеров ("Синтол", Россия), 2.5 ммоль MgCl2 и 1 ед. Taq-полимеразы ("Силекс", Россия). Выделение и очистку фрагментов из агарозного геля выполняли с использованием набора реактивов ("Силекс", Россия), согласно рекомендациям производителя. Секвенирование ДНК проводили в Межинститутском центре коллективного пользования "Геном" Института молекулярной биологии РАН (http://www.genome-centre.narod.ru/) с помощью набора реактивов ABIPRISM® BigDye™ Terminator v.3.1 ("Applied Biosystems", США) и с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABIPRISM 3730 ("Applied Biosystems", США) по прилагаемому к набору протокола.
Филогенетический анализ. Предварительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей фрагментов гена 16S рРНК проводили с помощью программного пакета BLAST (http: //blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Редактирование и выравнивание последовательностей проводили с помощью пакета программ Clustal_X [12]. Филогенетическое древо было построено на основании нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК штаммов 21, 14 и 42 и ближайших родственных видов рода Clostridium с помощью алгоритма "ближайших соседей" ("neibour-joining"), реализованного в пакете программ MEGA 4 [13, 14]. Длина масштабной линейки: 2 замены на 100 нуклеотидов (рис. 2.). Учетный номер базы данных GenBank на рисунках указан в скобках. Данные "bootstrap''-анализа (выраженные в процентах от 1000 реплик) указаны в точках ветвления. Полученные последовательности генов
100
55 69
34 31
99
71
99
100
|- С. sardiniense DSM 2632T (AB161367)
— С. barati АТСС27638т (Х68174)
— С. paraputrificum DSM2630T (Х75907) С. beijerinckii DSM791T (Х68179) С. saccharoperbutylacetonicum DSM 14923T (U16122)
- С. gasigenes DSM 12272T (AF092548)
74
82
— С. disporicum DSM 5521T (Y18176) С. septicum DSM 7534T (U59278)
С. tertium DSM 2485T (Y18174)
— штамм 24 (FJ606756) С. sartagoforme DSM 1292T (Y18175)
100
С. amylolyticum SW408T (EU037903)
97
86
99 42
С. lundense DSM 17049T (NR043235) - С. tetanomorphum DSM 4474T (DQ241819) -С. malenominatum DSM 1127T (FR749893)
99
-С. argentinense АТСС 27322T (Х68316)
ГС. pascui DSM 10365T (NR026322) - штамм 14 (FJ606759)
74
100
С. peptidovorans DSM 12505T (AF156796)
-С. hungatei DSM 14427T (FR749966)
-С. mangenotii DSM 1289T (FR733662)
56 35
100
42
45
62 51
0.02
С. difficile DSM 1296T (АВ075770)
-С. hiranonis DSM 13275T (АВ023970)
- С. sordellii DSM 2141T (АВ07577) С. ghonii DSM 15049T (АВ542933) С. irregulare DSM 2635T (Х73447) 100 штамм 21 (FJ606757)
L С. lituseburense DSM 797T (М59107)
-С. bartlettii WAL 16138T (AY438672)
С. mayombei DSM 6539T (FR733682) С. glycolicum DSM 1288T (Х76750)
100
Рис. 2. Филогенетическое древо, показывающее положение новых штаммов бактерий Clostridium sp., построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК.
Таблица 1. Образование жирных кислот метаногенным сообществом микроорганизмов
Продукт, г/л Время, сут
0 1 2 3 4 6 14
Бензолсульфонат
Ацетат 0 0 0.47 0.65 0.73 0.58 0.46
Пропионат 0 0 0.05 0.13 0.10 0.10 0.10
Бутират 0 0 0.05 0.06 0.06 0.06 0.06
Изобутират 0 0 0 0 0 0 0
Валерат 0 0 0.03 0 0.03 0 0
Гексаноат 0 0 0 0 0 0 0
п-толуолсульфонат
Ацетат 0.10 0.53 0.62 0.70 0.68 0.65 0.43
Пропионат 0.0 0.0 0 0 0.05 0.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.