РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2013, том 7(16), № 4, с. 377-384
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
АНАЛИТИЧЕСКИЙ ПОДХОД В ИЗУЧЕНИИ ПРОТИВОВИРУСНОГО И ИММУНОМОДУЛИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ПРЕПАРАТОВ НА МОДЕЛИ ГЕРПЕСВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ IN VITRO
© 2013 г. О.А. Свитич, Л.В. Ковальчук
Л.В. Ганковская*
В.Ф. Лавров, В.Б. Гервазиева, Т.М. Парфенова, А.Ю. Конищева, Г.Г. Головин, П.А. Лабжинов
*
ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН, Москва, Россия * ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Россия
Поступила: 04.02.2013. Принята: 30.07.2013
Целью данной работы являлось изучение механизмов противовирусной и иммуномоду-лирующей активности препаратов на модели герпесвирусной инфекции in vitro. В качестве модели была использована перевиваемая культура клеток Vero, инфицированная вирусом простого герпеса 1 типа (ВПГ-1). Исследование проводили с использованием 3-х схем опытов. Оценку молекулярных механизмов вируснейтрализующей и иммуномодулирующей активности проводили с использованием ОТ-ПЦР для определения уровней экспрессии а и в генов вируса герпеса простого, а также экспрессии распознающих структур врожденного иммунитета. Впервые показано, что природный комплекс цитокинов вызывает отсрочку синтеза вирусной ДНК на 6 часов и способствует повышению уровня экспрессии вирусной тимидинкиназы (ТК), что увеличивает эффективность лечения герпеса ацикловиром. Комплекс флавоноидов вызывал эффект достоверного снижения уровня экспрессии генов Ul48 и UL30, белковые продукты которых (вирусная полимераза и VP16) активно участвуют в жизненном цикле вируса простого герпеса. Изучение экспрессии генов, кодирующих распознающие (сигнальные) структуры врожденного иммунитета (Toll-подобные рецепторы — TLR) при добавлении в культуру клеток рабочих доз препаратов показало, что под влиянием данных препаратов отмечается увеличение уровня экспрессии гена TLR2 в 14 — 29 раз. Экспрессия эндосомального рецептора TLR9, при этом, изменяется незначительно. Эксперименты, направленные на изучение на молекулярном уровне противовирусного и иммуномодулирующего действия препаратов, по-видимому, смогут найти применение в практической сфере.
Ключевые слова: противовирусное действие, иммуномодулятор, in vitro
ВВЕДЕНИЕ
Герпесвирусные инфекции, вызываемые вирусами простого герпеса 1 и 2 типов, являются одними из наиболее распространенных и опасных вирусных болезней, поражающих человека. Легкость инфицирования, пожизненная персистенция вируса в организме хозяина, развитие вторичного иммунодефицита и ряда других серьезных осложнений, делают актуальной разработку методов эффективной профилактики и лечения этих заболеваний. Вторичный иммунодефицит, раз-
Адрес: 123557, Москва, Зоологический пер, д.8, кв.100. E-mail: svitichoa@yandex.ru
вивающийся при герпетической инфекции, характеризуется избирательным поражением клеток макрофагально-моноцитарного ряда, дефектами в системе интерферонов и других цитокинов [1].
Чувствительность организма к заражению вирусами простого герпеса генетически детерминирована и имеет наследственную составляющую. Нарушение иммунных механизмов, как правило, повышает восприимчивость к инфекции, способствует развитию более тяжелых форм заболевания [2]. На протяжении многих лет практически единственным эффективным противогерпетическим средством являлся ацикловир и другие препараты на его основе. Однако вскоре выяснилось, что
интенсивная противовирусная терапия ацик-ловиром привела к заметному снижению эффективности его действия, главным образом, за счет появления штаммов вируса, устойчивых к ацикловиру, а также ввиду низкой биологической доступности препарата [3, 4]. Все это стимулировало поиск новых лекарственных средств, обладающих высокой противовирусной активностью и безопасностью применения, активное изучение молекулярных механизмов их действия.
В настоящее время для лечения и профилактики герпесвирусных инфекций широко применяются разнообразные иммунотроп-ные терапевтические средства, препараты растительной природы, цитокиновые комплексы [5, 6].
Сбалансированный комплекс природных цитокинов и противомикробных пептидов (КПЦПП) состоит из интерлейкина-ф (1Ь-ф), интерлейкина-6 (1Ь-6), фактора некроза опухоли а (TNFa), миграцию ингибирующего фактора (М№), трансформирующих факторов роста Р1 (TFGpl) и р2 (TFGp2), а также протег-ринов — эндогенных пептидов, обладающих противомикробным действием. Установлено, что протегрины играют существенную роль в защите организма от патогенных агентов вирусной и бактериальной природы, подавляют рост грамположительных и грамотрицатель-ных микроорганизмов, грибов и некоторых вирусов [7, 8]. КПЦПП обладает широким спектром влияния на макрофаги, нейтрофи-лы и естественные киллеры — элементы системы врожденного иммунитета. Цитокины, входящие в состав комплекса, активируют фагоцитоз, продукцию 1Ь-ф, TNFa, IFNa и моноцитами, регулирует миграцию лейкоцитов, что, в итоге, приводит к реализации адаптивных механизмов противовирусного иммунного ответа [9, 10].
Известно, что иммуномодулятор растительного происхождения Протефлазид, в состав которого входят гликозилированные формы протеинов и флавоноидов, способен стимулировать в организме больного продукцию а- и у-интерферонов, а также усиливать противовирусную активность макрофагов [6]. При этом информация о молекулярных механизмах противовирусного действия данного растительного экстракта, в том числе, о его влиянии на геном, в частности, вируса простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), этиологического агента генитального герпеса, практически отсутствует.
Целью данной работы была разработка системы изучения механизмов противовирусной и иммуномодулирующей активности лекарственных препаратов in vitro, в основу которой заложена оценка их влияния на экспрессию вирусных белков и распознающих рецепторов системы врожденного иммунитета.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Характеристика культуры клеток и вируса простого герпеса
Перевиваемая культура клеток Vero получена из Института им. Пастера (С-Петербург). Источником клеток являются почки африканской зеленой мартышки. Вирус простого герпеса 1 типа (штамм VR-3), вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS) были получены из Национальной вирусной коллекции (Великобритания). Клетки Vero заражали вирусом простого герпеса и культивировали 24 ч в полной среде RPMI-1640/ DMEM (2:1) с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки (2%). Культивирование клеток проводили в 96-луночных плоскодонных полистироловых планшетах (COSTAR, США).
Характеристика препаратов
КПЦПП был получен из культуры стимулированных лейкоцитов периферической крови по запатентованной методике (Патент РФ 21455 оо) [9]. В опытах препарат использовался в виде лиофилизированного порошка (в ампулах по 100 мкг).
Комплексное растительное соединение протеинов и флавоноидов — препарат Про-тефлазид был получен из НПК «Экофарм», Украина.
Оценка жизнеспособности клеток с помощью витального красителя Neutral Red и МТТ-теста
Краситель Neutral Red (NR) (3,33 г/л) 3-х кратно разводили средой Игла, доводя его объём до 1,11 мг/мл. Через 5 суток после заражения монослоя клеток Vero вирусом, в каждую лунку 96-луночного плоскодонного планшета добавляли по 50 мкл разведённого красителя, предварительно удалив из лунок среду культивирования. Планшет инкубировали в тече-
ние 2 ч при 37°С в 5% атмосфере СО2. Затем монослой клеток трижды отмывали средой Игла и в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора (50% EtOH/50% 0,1М NH4H2PO4, pH-3,5). Результат оценивали через 30 мин с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм.
Постановку МТТ-теста проводили по модифицированной методике, описанной Niks M., Otto M. [11]. В каждую лунку с монослоем клеток Vero вносили по 50 мкл раствора МТТ (1,5 мг/мл) и инкубировали в течении 2 ч при 37°С в атмосфере 5% СО2. После инкубации монослой клеток в лунках трижды отмывали от красителя средой Игла и в каждую лунку добавляли по 100 мкл раствора ДМСО. Через 15 мин инкубации результат оценивали с помощью спектрофотометра при длине волны 490 нм.
Схемы экспериментов
Для изучения протективного противовирусного действия КПЦПП были проведены эксперименты, включающие предварительную, до заражения вирусом, обработку клеток Vero комплексом в концентрации 100 мкг/мл с последующим их инфицированием ВПГ-1 (0,1-0,000001 ТЦД50/кл) через 1, 3 и 24 ч после обработки препаратом.
Для исследования действия комплекса на инфицированную вирусом культуру клеток были проведены опыты, в которых культуру клеток Vero сначала заражали вирусом в дозах от 0,1 до 0,000001 ТЦД50/кл, а через 1 час после инфицирования к клеткам добавляли 100 мкг/мл препарата.
Оценка прямого (вне культуры клеток) противовирусного действия препарата осуществлялась в экспериментах, в которых вируссодержащую жидкость (с титром вируса 7,8 ТЦД50/кл) инкубировали с КПЦПП (100 мкг/мл) в течение 2-х ч при 37оС. Далее часть вируссодержащего материала анализировали с помощью электронного микроскопа совместно с руководителем группы электронной микроскопии ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН В.Д. Лотте [12], вторая часть вируссодержащей жидкости была использована для заражения культуры клеток Vero с целью определения титра полученного вируса. В качестве контролей были использованы: неинфицированная вирусом культура клеток Vero; неинфицированные вирусом и обработанные 100 мкг/мл КПЦПП
клетки Vero; инфицированная ВПГ-1 в дозах 0,1-0,000001 ТЦД50/кл культура клеток Vero. Оценка титра вируса осуществлялась на 6-е сутки культивирования по методу Рида и Менча [13].
Молекулярно-биологические методы исследования
Выделение ДНК и РНК из клеток проводили с помощью метода фенол-хлороформной экстракции [14], а также с использованием набора «РибоСорб» (ИЛС, Россия). В качестве отрицательных контролей использовали незараженную культуру клеток Vero и клеточную культуру, обработанную препаратами. В дальнейшем на матрице РНК проводили реакцию обратной транскрипции [14]. Прай-меры для реакции обратной транскрипции (ОТ) и полимеразной цепной реакции (ПЦР), были смоделированы с помощью программы VectorNTI 8,0 в соответствии с последовательнос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.