БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 8, с. 974 - 984
УДК 577.217
АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ И РЕГУЛЯЦИИ УДЛИНЕННОГО «-10» rpsB-ПРОМОТОРА Escherichia coli in vivo* **
© 2014 Л.В. Асеев, Л.С. Колединская, И.В. Бони***
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; факс: (495)330-6538, электронная почта: irina_boni@ibch.ru
Поступила в редакцию 21.04.14 После доработки 15.05.14
Как мы показали ранее, транскрипция оперона rpsB-tsf, кодирующего жизненно важные компоненты трансляционного аппарата — рибосомный белок S2 и фактор элонгации Ts, направляется единственным промотором PpsB, который высоко консервативен у гамма-протеобактерий. P sB относится к классу удлиненных «-10»-промоторов и включает TGTG-удлинение перед «-10»-гексамером ТАТААА, субоптимальную область «—35» (TTGGTG) и GC-богатый дискриминатор (GCGCGC), отделяющий «-10»-элемент от транскрипционного старта. В данной работе мы исследовали влияние направленных мутаций в rpsB-промо-торной области на экспрессию репортерного гена PrpsB-lacZв составе хромосомы E. coli, а также регуляцию промотора транскрипционными факторами ppGpp и DksA при аминокислотном голодании. Показано, что уровень транскрипции зависит как от TGTG-удлинения, так и от TTG-элемента в области «—35», и мутации в этих природных последовательностях приводят к очень сильному снижению промоторной активности. При индукции аминокислотного голодания rpsB-промотор негативно регулируется ppGpp благодаря присутствию GC-богатого дискриминатора, замена которого на АТ-богатый элемент упраздняет строгий контроль. Эти и другие полученные данные показывают необходимость сочетания всех консервативных элементов rpsB-промотора для эффективной и регулируемой транскрипции жизненно важного оперона rpsB-tsf.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: оперон rpsB-tsf, удлиненный «—10» промотор, сайт-направленный мутагенез, ppGpp/DksA, GC-богатый дискриминатор, строгий контроль.
Транскрипция играет важнейшую роль в регуляции генной экспрессии. В бактериальной клетке транскрипция направляется единственной РНК-полимеразой, которая состоит из 6 субъединиц: 5 субъединиц образуют кор-фермент (а2в Р'ю), который обладает полимеразной активностью, а для узнавания промоторных последовательностей и определения старта синтеза РНК к кор-ферменту присоединяется а-фактор, в результате чего образуется холофермент [1—3]. Большинство бактерий используют набор а-фак-торов, которые позволяют инициировать транскрипцию нужных генов в ответ на изменения
Принятые сокращения: 5'-НТО — 5'-нетранслируе-мая область; ТИР — трансляционный инициаторный район; ПЦР — полимеразная цепная реакция; ОТ — обратная транскрипция, RBS — участок связывания рибосомы (ribosome binding site), OD600 — оптическая плотность при 600 нм, п.о. — пара оснований.
* Ускоренная публикация.
** Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-105, 29.06.2014.
*** Адресат для корреспонденции.
внешней среды [3]. У Escherichia coli — семь а-факторов. Главный фактор (а70) направляет транскрипцию подавляющего большинства оперонов в экспоненциальной фазе роста и имеет наибольшую афинность к кор-ферменту; другие шесть а-факторов контролируют оперо-ны, которые включаются в определенных условиях [2—6].
В настоящее время уже многое известно о модульном строении промоторов и роли каждого элемента в образовании специфических контактов с холоферментом [5—9]. Взаимодействие РНК-полимеразы с а70-зависимыми промоторами изучено в деталях и может быть представлено в виде наглядной схемы (рис. 1, а). Процесс образования продуктивного комплекса включает несколько этапов: узнавание и связывание двуспиральной ДНК (закрытый комплекс, или RPc), плавление ДНК и образование транскрипционного пузыря (transcription bubble), изомеризация ДНК и РНК-полимеразы через ряд промежуточных состояний (RPi) и формирование открытого комплекса (RPo), способного связать инициирующий трифосфат и вступить в
элонгацию (рис. 1, б) [5]. Для продуктивной элонгации необходимо последовательное разрушение установившихся контактов между а-фактором и промоторной областью [1, 10]. В узнавании двуспиральной промоторной ДНК участвуют различные домены а70-фактора (рис. 1, а): участок 4.2 узнает гексамер (—35)ТТ0ЛСЛ(—30), участок 3 — удлиненный —10 элемент (—17)ТЯТОп(—14). Узнавание —10-элемента (—12)ТЛТЛЛТ(—7) в виде дуплекса (кроме позиции —12) почти исключено, и все контакты а70-фактора ниже позиции —12 в гексамере —10 устанавливаются с нематричной цепью ДНК в процессе плавления промотора [11]. С -10-эле-ментом контактируют участки а70 2.3 и 2.4, при этом для оснований А(—11) и Т(—7), наиболее консервативных у а70-промоторов, предназначены специализированные «карманы» [11]. Участок а70 1.2 взаимодействует с областью дискриминатора [5] (рис. 1, а). Помимо а70 в узнавании промоторной ДНК участвуют С-кон-цевые домены а-субчастиц РНК-полимеразы (аСГО на рис. 1, а), они взаимодействуют с так
называемым UP-элементом, A/T-богатым участком перед гексамером —35 (позиции от —57 до —38), но это взаимодействие не является существенным для многих промоторов [5].
Несмотря на столь ясную картину взаимодействий РНК-полимеразы с промоторными элементами, предсказать силу промотора на основании последовательности ДНК сложно [7]. Еще труднее предсказать механизмы регуляции индивидуальных промоторов, так как теоретически они очень многообразны. Регуляция на уровне инициации транскрипции осуществляется с помощью различных транскрипционных факторов, которые взаимодействуют либо с ДНК (репрессоры и активаторы), либо с РНК-полимеразой (например, алармон ppGpp, белки DksA, GreA, GreB, малая РНК 6S) [2, 5]. Для выяснения механизмов контроля необходимы усилия экспериментаторов.
Ряд природных промоторов и их регуляция изучены достаточно подробно [5, 7]. В первую очередь следует назвать Р1-промоторы rrn-опе-ронов рРНК E. coli, которые на примере rrnB P1
а
=| UP-clcmcnt Ы
I lin 1 Hic:
-JD TTGACA -1 П,Х1 | TRTGi 1 -10 1 i TAT A AT aïs H
17 п.о.
б
R+P RPc
RPi
RPo
NTP
kd
в
rrnB PI:
^35.
-10
TTGTCA
GGCCGGAATAACTCCCTATAAT
16 n.o.
+1
GCGCCACCA
dis ~
1
2
3
4
Рис. 1. Инициация транскрипции на а70-промоторах. а — Взаимодействие бактериальной РНК-полимеразы (холофермен-та a2ßß'roa70) с промоторной областью ДНК. UP-элемент — А/Т-богатый район ДНК, с которым взаимодействуют С-кон-цевые домены a-субчастиц (aCTD); 1, 2, 3, 4 — области а70, вовлеченные в узнавание промоторных элементов; dis — дискриминатор; в случае удлиненных TRTGn-промоторов (ext) R — пурин, n — любое основание; б — схема процесса образования транскрипционного инициаторного комплекса [5]. R — РНК-полимераза, Р — промотор, RPc — первичный комплекс РНК-полимеразы с промоторной ДНК, в котором ДНК еще не расплавлена (закрытый комплекс); RPо — открытый комплекс, в котором промоторная область расплавлена и который способен к связыванию инициирующего нуклеозид-трифосфата (NTP) и переходить в стадию элонгации; RPi — промежуточные комплексы; ka — суммарная константа образования RPo, kd — константа диссоциации RPo; в — структура промотора Р1 оперона rrnB (кроме UP-элемента)
исследованы досконально как in vivo, так и in vitro [5]. Эталонный промотор rrnB P1 очень эффективен в условиях роста на богатой среде, но его активность быстро реагирует на изменение внешних условий. Регуляция запрограммирована в структуре промотора (рис. 1, в). Сочетание оптимальных и неоптимальных промоторных элементов обеспечивает эффективное образование закрытого комплекса RPc и его переход в короткоживущий открытый комплекс RPo, при этом именно короткое время жизни RPo гарантирует ответ на внешние сигналы [5]. Оптимальными элементами являются гексамеры —35 и —10, неоптимальными — расстояние между ними, а также между — 10-элементом и стартом транскрипции (8 позиций, тогда как для большинства промоторов 6), GC-богатый дискриминатор и слабое взаимодействие а1.2 с основанием двумя позициями ниже -10-элемента (рис. 1, в). Именно строение области дискриминатора позволяет снижать активность рибосом-ных промоторов при недостатке питательных веществ (т.н. строгий ответ, stringent response) [5]. Это играет важнейшую роль для выживаемости клетки, помогая перераспределять клеточные ресурсы в условиях, когда уменьшается потребность в новых рибосомах и возникает необходимость в синтезе аминокислот и антистрессовых факторов. Недавно было показано, что не только промоторы рРНК и тРНК, но и ряд промоторов оперонов рибосомных белков (р-белков) снижают активность при голодании [12]. Однако способность к строгому ответу исследована далеко не для всех промоторов р-бел-ковых оперонов, а различия в их строении не позволяют предсказать общие контрольные механизмы.
Целью данной работы было исследование структуры и регуляции промотора оперона rpsB-tsf, кодирующего жизненно важные компоненты трансляционного аппарата — р-белок S2 и
фактор элонгации Ts. Недавно мы впервые локализовали rpsB-промотор и предположили его строение на основе сравнительного анализа областей ДНК перед rpsB-геном гамма-протеобак-терий [13, 14]. Филогенетический анализ выявил консервативность необычной структуры промотора, которая сочетает разнонаправленные элементы (рис. 2). Так, TRTG-удлинение перед —10-элементом (—12)ТАТААА(—7) по литературным данным должно стабилизировать открытый комплекс [15], а GC-богатый дискриминатор и неоптимальные позиции —7 (А вместо Т) и —5 (С вместо G) являются признаками короткоживущего (short-lived) RPo [5, 7]. С помощью сайт-направленного мутагенеза мы оценили вклад различных элементов rpsB-промото-ра в его эффективность и способность к регуляции при аминокислотном голодании. Результаты показали, что TGTGn-удлинение обеспечивает высокую транскрипционную активность на богатой среде. В то же время, rpsB-промотор способен снижать активность при строгом ответе параллельно с rrnB Р1-промотором благодаря структуре дискриминатора. Подобная негативная регуляция для TRTGn-промоторов показана впервые.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАН
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.