НЕЙРОХИМИЯ, 2011, том 28, № 1, с. 60-77
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.886:612.014.45
АНАЛИЗ ДИНАМИКИ ДЕГЕНЕРАТИВНЫХ И РЕГЕНЕРАТИВНЫХ ПРОЦЕССОВ ВО ФЛЕКСОРНОМ И ЭКСТЕНЗОРНОМ ОТВЕТВЛЕНИЯХ СЕДАЛИЩНОГО НЕРВА
ПОСЛЕ ЕГО СДАВЛИВАНИЯ; ДЕЙСТВИЕ ПАРАТИРЕОИДНОГО ГОРМОНА
© 2011 г. А. Л. Минасян1, А. В. Азнаурян1, И. Б. Меликсетян2, В. А. Чавушян2, Дж. С. Саркисян2*
1 Ереванский государственный медицинский университет им. М. Гераци, Ереван, Армения 2Институт физиологии им. Л.А. Орбели НАН РА, Ереван, Армения
С использованием морфологического, гистохимического и электрофизиологического методов анализа проводили сравнительные исследования изменения состояния седалищного нерва крыс через определенные промежутки времени после его сдавливания. Измерение ферментативной активности Са2+ зависимой кислой фосфатазы (КФ) в срезах нервных волокон использовали для определения продолжительности процессов восстановления нервов. Для ускорения процесса реабилитации поврежденного нерва использовали системное введение паратиреоидного гормона (ПТГ). Выявлена пролиферация клеток эндоневрия и Шванновских клеток уже на третьи сут после сдавливания в ипсилатеральном экстензорном (N. peroneus communis) и флексорном пучках волокон (N. gastrocnemius), а на 7-й — 9-й дни — полное восстановление активности КФ. Спустя 5—35 дней после сдавливания седалищного нерва проводили опИпе-регистрацию и программный математический анализ импульсной активности. В контроле, в период с 35-го по 70-й день, в ответ на высокочастотную стимуляцию нервов наблюдали регенерацию лишь экстензорного нерва, сопровождающуюся изменением направления волокон. При применении ПТГ процесс регенерации значительно ускорялся, при этом наблюдали раннюю регенерацию флексорного нерва с более упорядоченной морфологией волокон. Показана корреляция результатов электрофизиологических исследований и данных мор-фо-гистохимического анализа.
Ключевые слова: седалищный нерв, сдавливание нерва, мотонейроны, спинной мозг, высокочастотная стимуляция, экстензорный и флексорный нервы, паратиреоидный гормон.
ВВЕДЕНИЕ
Дегенерация и регенерация периферического нерва (ПН) в условиях его сдавливания — предмет интенсивного исследования. Подобное воздействие вызывает изменения функционирования ряда механизмов, среди которых особый интерес представляют: 1) регенерация сенсорных и моторных нейронов; 2) аксонный спраутинг мотонейронов (МН) в задних столбах спинного мозга; 3) пре-синаптическая афферентная деполяризация и пре-синаптическое торможение; 4) действие факторов роста и нейротрофинов; 5) реакция глии [1]. Исследование данных процессов способствует объективной оценке изменений, происходящих не только в очаге сдавливания, но и за его пределами. В частности, показано, что хроническое сдавливание ПН
* Адресат для корреспонденции: 0028 Республика Армения, Ереван, ул. Бр. Орбели, 22; тел.: + (347 10) 273 863, e-mail: johnsarkissyan@gmail.com
вызывает как апоптоз, так и пролиферацию шванновских клеток (ШК) [2]. Как известно, дистальная культя нерва при сдавливании претерпевает уолле-ровскую дегенерацию, при которой порождается микросреда, способствующая прорастанию регенерирующих волокон (3—4 мм/день) от проксимального обрубка. Этот процесс может быть поддержан фармакологическими препаратами [3]. В ШК на фоне пролиферации наблюдается торможение экспрессии генов миелина и дифференцировки. Выстраиваясь в трубочки (ленты Бюнгнера), ШК экс-прессируют поверхностные молекулы, участвующие в регенерации волокна. В дистальной культе происходят также молекулярные изменения, включающие, в частности, стимуляцию активности ней-ротрофинов и цитокинов [3]. Кроме того, сдавливание приводило к полному торможению функционирования ПН, которое, однако, восстанавливалось до контрольного уровня по прошествии около 4 нед [2, 4].
Исследования, направленные на предотвращение инвалидности, и поиск оптимальной терапевтической стратегии для успешной регенерации при повреждениях ПН [5], в частности при сдавливании, интенсивно проводятся на междисциплинарном уровне с испытанием целого ряда средств, включающих факторы роста, нейротрофины, гормоны, экзогенные пептиды и другие физиологически активные соединения, а также физические воздействия [6—11]. Особый интерес вызывает возможность использования при ПН повреждении паратиреоидного гормона (ПТГ), являющегося фе-нотипическим признаком ШК [12]. Можно полагать, что флексорный нерв как эволюционно более поздняя структура по всей видимости будет позже восстанавливаться и не без фармакологической интервенции.
В настоящей работе проведены сравнительные морфо-гистохимические и электрофизиологические исследования динамики нейродегенеративных и регенеративных процессов, происходящих во флек-сорных (N. Gastrocnemius, G) и экстензорных (N. Peroneus communis, P) нервах нижней конечности крыс после сдавливания седалищного нерва (СН), а также изучено влияние на эти процессы ПТГ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперименты проводили на крысах-самцах Альбино (250 ± 30 г): интактных (n = 7) и подверженных одностороннему сдавливанию СН в контроле (n = 11) и в условиях применения ПТГ (n = 7). Сдавливание СН проводили в верхней трети бедра (на 4 мм выше трифуркации) под нембуталовым наркозом (40 мг/кг в/б). ПТГ вводили в/м, начиная со следующего дня после сдавливания СН ежедневно в течение 7 дней по 0.35 мл раствора (10-9 М). Проводили сравнительный анализ сенсорного (тест рефлекса отведения) и моторного (статический седалищный индекс) показателей функционального восстановления после сдавливания. В электрофизиологическом эксперименте спустя 5, 13, 16, 21, 25, 32, 35, 70 дней в контроле и 1, 3, 5, 7, и 9 дней после инъекций ПТГ под нембуталовой анестезией после фиксации в стереотаксическом аппарате проводили кранеотомию, дорсальную ламинэктомию пояс-нично-крестцового отдела спинного мозга и отделение дистальных флексорного и экстензорного ответвлений сдавленного СН. Затем животных обездвиживали 1%-ным дитиллином (25 мг/кг в/б) и переводили на искусственное дыхание. Стеклянные микроэлектроды с диаметром кончика 1 мкм, заполненные 2 М раствором NaCl, вживляли в передние рога серого вещества поясничных сегментов (L4—L5) в область МН спинного мозга (VIII—IX пла-
стины по Рекседу) для экстраклеточной регистрации их спайковой активности.
Высокочастотную стимуляцию (ВЧС) нервов Gi и Pi задних конечностей (на ипсилатеральной стороне по отношению к повреждению, i) осуществляли биполярными серебряными электродами (параметры тока 0.05 мс, 0.10—0.16 мА, 50 Гц в течение 1 с). Стереотаксически ориентированными по атласу мозга [13] цилиндрическими биполярными электродами осуществляли стимуляцию гигантоклеточ-ного красного ядра и латерального вестибулярного ядра, т.е. структур центрального контроля (параметры тока 0.05 мс, 0.08 мА, 50 Гц в течение 1 с), причем для идентификации МН использована парная ре-ципрокность эффектов стимуляции центральных структур, участвующих в облегчении или торможении флексии и экстензии или соответствующих периферических структур [14].
Для определения статистической достоверности различий в длительности межспайковых интервалов до и после действия стимула использован непараметрический критерий проверки однородности двух независимых выборок (Wilcoxon-Mann-Whitney test). Так как число регистрируемых спайков было достаточно велико (до нескольких сотен спайков за 10-секундный интервал после действия стимула), использована разновидность указанного теста, учитывающая его асимптотическую нормальность, — z-тест. Сравнение критических значений с табличными значениями нормального распределения при уровнях значимости 0.05, 0.01 и 0.001 (для различных испытаний), показывает, что в результате ВЧС для большинства выборок спайкинга нейрональ-ной активности имеется статистически значимое изменение как минимум с уровнем значимости 0.05.
Для морфологического анализа (n = 18) нерв после электрофизиологического эксперимента фиксировали в течение 3-7-и дней в 10%-ном растворе нейтрального формалина (лучшие результаты наблюдали при более длительном уплотнении материала в фиксаторе). Замороженные продольные срезы толщиной 30—40 мкм переносили в свежеприготовленную инкубационную смесь для определения активности Са2+-зависимой кислой фосфа-тазы (КФ) [15]. Для выявления активности фермента нами предложена смесь, содержащая 20 мл 0.40%-ного раствора уксуснокислого свинца, 5 мл 1 М ацетатного буфера, рН 5.6 и 5 мл 1%-ного раствора ß-глицерофосфата натрия. Этот состав доводился 3%-ным раствором хлористого кальция до 100 мл. Инкубацию проводили в термостате при 37° в течение 3—4 ч. После промывки срезы проявляли в 3%-ном растворе сульфида натрия и помещали в бальзам.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Морфо-гистохимический анализ. В первые сутки на месте сдавливания нерва активность КФ была резко снижена, а на границах дистального и проксимального отделов активность КФ отсутствовала (рис. 1а, светлая полоса). Через 5 дней после сдавливания (рис. 1б) в дистальном отделе проявляются полые шванновские трубочки, которые в области травмы расслаиваются и выглядят в виде "обрубков". Возможно, они меняют направление и переходят в другую плоскость сечения. Из проксимального участка среди расширенных, прерывистых ми-елинизированных пучков нервных волокон прослеживаются коллатерали. В большинстве случаев нервные волокна имеют косое расположение. В некоторых местах заметны темные скопления ми-елиновых "обломков", из которых исходят тонкие прерывистые волокна.
На 13-й день после сдавливания в дистальном и проксимальном отделах обнаруживается высокая активность КФ. При этом наблюдается слабая пролиферация ядер ШК. Из проксимального отдела видны светлые расширенные извилистые трубочки разного размера (рис. 1в), среди которых часто обнаруживаются пучки миелинизированных нервных волокон с характерной волнообразностью. Они постепенно заполняют участок сдавливания. В ди-стальном отделе также прослеживаются единичные миелинизированные пучки. В отдаленных от места травмы участках характерная для нерва волнообразная структура сохраняется, хотя местам
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.