БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 2, с. 316-321
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.336:579.843.083.13
АНАЛИЗ ДИНАМИКИ ИНТЕНСИВНОСТИ БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ СВЕТЯЩИХСЯ БАКТЕРИЙ Photobacterium phosphoreum © 2015 г. А.В. Дроздов, Е.Н. Громозова*, И.А. Грецкий*
Институт аналитического приборостроения РАН, 198095, Санкт-Петербург, ул. Ивана Черных, 31-33, лит. А ; *Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Д03680, Украина, Киев, ул. Академика Заболотного, 154 E-mail: ау@ЫорЪу$.ти Поступила в p едакцию 10.02.14 г. Посте доpаботки 17.11.14 г.
П pедставлены pезультаты анализа динамики биолюминесценции cветящиxcя бактерий Photo-ba€terium р^5р^геит ИМВ В-7071 при оптимальные уcловияx иx pоcта. Обнаpужен квази-гаpмоничеcкий xаpактеp динамики биолюминеcценции бактеpий. Наблюдаемые пеpиоды этиx изменений имеют cxожие значения c уcтановленными нами pанее пеpиодами изменений физико-xимичеcкиx cвойcтв воды. Обcуждаютcя вопpоcы cвязи между биоpитмикой и квази-гаpмоничеcким xаpактеpом изменения физико-xимичеcкиx cвойcтв воды.
Ключевые слова: биолюминесценция, светящиеся бактерии, ритмические процессы, биоритмы, свойства воды.
Изучение пеpиодичеcкиx изменений харак-теpа интенcивноcти биологичеcкиx пpоцеccов и явлений как на уpовне функциониpования отдельных клеток [1], так и на уpовне целостных организмов [2-5] в настоящее время представлено очень обширно. Имеющиеся литературные данные позволяют утвер ждать, что временную организацию биологических систем необходимо хар актеризовать целым спектром периодов различной длительности [6]. Среди факторов, обсуждаемы х в качестве пр ичин, вызывающих колебания в биологических системах, указываются: космофизические воздействия, колебания магнитного поля Земли, ритмы солнечной активности и т.д. [7-10]. Однако вопрос о меха -низме/механизмах действия этих факторов на биологические системы до сих пор остается предметом острых научных дискуссий.
Целью настоящего исследования являлось выявление таких ритмов в целостной биологической системе, что позволило бы в дальнейшем использовать ее в экспериментах по изучению механизма/механизмов влияния внешних физических факторов низкой интенсивности (в том числе космофизического и геомагнитного про -исхождения) на динамику биологических про -цессов. Для этой цели хорошо подходят светящиеся бактерии, люминесценция которых в видимой области спектра характеризуется высо-
кой чувствительность и скор остью реакции-ответа на действие р азличных факторов и легко регистрируется приборными методами. В работе [11] были описаны колебательные ритмы свечения одиночных бактерий импульсного ха -рактера.
К светящимся бактериям относится разнородная группа микроорганизмов, обладающая способностью испускать свет в зелено-голубой области спектра видимого диапазона. Она включает в себя 17 видов, большинство из которых являются морскими представителями. Светящиеся бактерии РНоюЬаавпит рНо8ркогв-ит отличаются ср еди прочих наиболее длительным и интенсивным свечением [12].
Таким образом, целью настоящей работы явилось исследование динамики биолюминесценции РНоЮЬаавпит рНо8рНогвит в условиях роста колоний на плотной питательной среде при оптимальных условиях их роста.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объект исследования - штамм морских светящихся бактерий Р. рНо8рНогвит, зарегистрированный в Депозитарии микроорганизмов Института микробиологии и вирусологии им. Д .К. Заболотного НАН Украины под номером ИМВ В-7071.
Для изучения динамики биолюминесценции использовали одиночную колонию светящихся бактерий, растущую на агаризованной синтетической питательной ср еде следующего состава (г/л): пептон - 5,0; дрожжевой экстракт -1,0; ШС1 - 30,0; Ка2ЫР04 - 5,3; КЫ2Р042Ы20 -2,1; (КЫ4)2ЫР04 - 0,5; ]^04-7Н20 - 0,1; агар-агар - 20,0; глицерин - 3,0 мл/л, вода дистиллированная - до 1 л, рН 7,6. Методика культивирования бактерий Р. рНо8ркогеыт подробно описана в работе [13].
Динамику интенсивности свечения бактерий изучали на экспериментальной установке, изготовленной в нашей лаборатории. Методика измерений заключалась в том, что световой поток (X = 490 нм) от образца со светящимися бактериями с помощью светосильного высоко-апер турного объектива (А = 0,7) фокусир овался на фотокатод фотоэлектронного умножителя ФЭУ-115. Напр яжение питания ФЭУ составляет и = 1,3 кВ при I = 1,5 мА. Анодный ток ФЭУ усиливался прецизионным усилителем, работающим в режиме преобразователя тока-напряжения. Выходное напряжение с усилителя регистрировали мультиметром с высоким входным сопротивлением. Блок-схема установки для измерения бактериальной биолюминесценции пред ставлена на р ис. 1.
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВ
Измерение интенсивности свечения бактерий пр оисходило в темной комнате. На первом этапе измеряли уровень «темнового» сигнала фотоумножителя - иа, затем под объектив помещали обр азец с бактер иями и измер яли сигнал от образца, содержащего колонию бактерий РНогоЪаегепит phosphoreum ИМВ В-7071, - и1. Интенсивность сигнала от бактерий превосхо-дила уровень «темнового» сигнала более чем на два порядка. Для дальнейшего анализа использовали разностный сигнал и = и 1 - иа, который был пропорционален интенсивности бактериального свечения.
Интенсивность биолюминесценции регистрировали один раз в минуту (с точностью 0,1 с) в течение трех часов. На результаты анализа частота выборки, с которой проводили снятие экспериментальных данных, не влияла. Температур у окружающей ср еды в помещении, в котором проводили эксперименты, поддерживали на уровне (22,0 ± 0,5)°С. Исследование динамики свечения колонии проводили в разные ср оки культивирования клеток (на 3-и; 5-е; 6-е сутки).
Рис. 1. Блок-схема экспериментальной установки. Пояснения в тексте.
Окончательным этапом исследования являлся частотно-временной анализ интенсивности бактериального свечения.
Необходимо заметить, что получаемые в ходе выполнения работы результаты были сильно зашумленными и являлись нестационарными во вр еменной области. Все это создавало тр уд-ности для анализа получаемых данных с помощью общепринятых подходов (преобразований Фурье). В этой связи частотно-временной анализ получаемых экспериментальных результатов осуществлялся с помощью вейвлет-пре-обр азования в ср еде МЛТЬЛБ 7.11. В качестве базисной функции вейвлет-преобразования использовали вейвлет Морле.
Вейвлет-преобразование является обобщением спектрального анализа, типичный представитель которого - классическое преобразование Фур ье. П ри анализе нестационар ных сигналов, за счет свойства локальности, вейвлеты получают существенное преимущество перед преобр азованием Фур ье, которое дает нам только глобальные сведения о частотах исследуемого сигнала. В отличие от традиционного преобразования Фурье, вейвлет-преобразование обеспечивает двухмерную развертку исследуемого одномерного сигнала, при этом частота и координата (время появления этой частоты в экспериментальном сигнале) рассматриваются как независимые переменные.
Вейвлет-преобразование используют в тех случаях, когда результат анализа некоего сигнала должен содержать одновременно не только простое пер ечисление его хар актерных частот, но и сведения об определенны х локальных координатах (время), при которых эти частоты проявляют себя. Таким образом, анализ и обработка нестационарных (во времени) или не-однор одных (в про стр анстве) сигналов разных типов представляют собой о сновное поле применений вейвлет-анализа.
Рис. 2. Динамики интенсивности биолюминесценции бактерий РкогоЪасгвпит рковркогвит ИМВ В-7071. (а) -Реальная динамика интенсивности свечения бактерий Р. рковркогвит, (б) - вейвлет-преобразование этой динамики.
П роведенное нами отдельное ср авнение результатов, полученных с помощью вейвлет-пр е-обр азования, с результатами классического пр е-обр азования Фурье показало хор ошее совпадение значений гар монических составляющих, полученных разными методами [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результат мониторинга изменения интенсивности биолюминесценции бактерий РНоЮЪаМв-т1ит рко8ркогвит ИМВ В-7071 при культивировании в оптимальных для их р азвития условиях представлен на рис. 2а. Вейвлет-анализ экспериментальных данных показал (рис. 2б), что динамика интенсивности биолюминесценции подчинялась определенным закономерностям и имела квазипериодический характер (рис. 3). Полученные в ходе выполнения данной работы результаты свидетельствуют о том, что в интенсивности свечения биолюминесценции наблюдаются опр еделенные периоды. Значения периодов интенсивности свечения бактерий, об-нар уженных в ходе выполнения данной работы, составляют: 6-9, 11-13, 15-18, 21-29, 30-39, 4055, ~60 мин. Амплитуды этих колебаний варьируются до 10% от среднего значения уровня биолюминесценции (рис. 3).
Для оценки степени влияния измерительной аппаратуры на обнаруженный квазигармонический характер интенсивности свечения бактерий нами были проведены дополнительные эксперименты. Сравнивали динамику интенсивности свечения стабильного источника света (уровень интенсивности соответствовал уровню свечению бактерий) с динамикой биолюминесценции бактерий. Дополнительно сравнивали динамику интенсивности «темнового» сигнала фотоумножителя все с той же динамикой излучения бактерий. Сравнение результатов вейвлет-анализа всех перечисленных выше динамик свидетельствуют о том, что обнаруженные периоды наблюдаются только в динамике биолюминесценции бактерий.
Следует отметить, что в процессе культивирования колоний Р. рко8ркогвит ИМВ В-7071 значения периодов характеризовались хорошей воспроизводимостью, но не присутствовали полным набором в различных экспериментах. Для объяснения этого факта необходимо понимание механизма наблюдаемой ритмики, но такая задача в рамках данной работы не ставилась.
Анализ динамики свечения в разные ср оки культивирования бактерий показал, что с увеличением возраста культуры в динамике излучения исчезала гармоническая составляющая с
Рис. 3. Мультимодальный характер динамики интенсивности биолюминесценции бактерий Р^гоЪаегепит р^з-р^геит ИМВ В-7071 (гармонические составляющие динамики интенсивности свечения вдоль соот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.