ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 3, с. 205-212
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ В РАЗВИТИИ И ПРИ РЕПРОГРАММИРОВАНИИ
УДК 575.16
АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ РОДИТЕЛЬСКИХ АЛЛЕЛЕЙ Xist И Gla В МЕЖВИДОВЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ГИБРИДНЫХ КЛЕТКАХ В УСЛОВИЯХ ИНДУЦИРОВАННОЙ in vitro ИНАКТИВАЦИИ
Х-ХРОМОСОМ
© 2007 г. М. В. Пузаков, Н. Р. Баттулин, С. А.Темирова, Н. М. Матвеева, Н. А. Сердшкова, А. С. Графодатский, О. Л. Серов
Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, пр-т Лаврентьева, д. 10 E-mail: serov@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 02.05.06 г.
Гибридизация in situ с использованием меченых видоспецифичного и специфичного для Х-хромосо-мы зондов показала, что в гибридных клетках, полученных путем слияния эмбриональных стволовых клеток Mus musculus (генотипа XY) и спленоцитов самки Mus caroli, присутствуют две родительские Х-хромосомы. В пяти клонах гибридных клеток через образование in vitro эмбриоидных телец была индуцирована дифференцировка, процесс которой сопровождался инактивацией в клетках одной из Х-хромосом. С помощью обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции мы провели анализ экспрессии аллелей генов Xist и Gla в эмбриоидных тельцах с учетом того, что экспрессия локуса Xist является одним из ключевых событий инактивации Х-хромосом, а ген Gla использован в качестве маркера активной Х-хромосомы. Идентификация аллельных транскриптов локусов Xist и Gla была основана на обнаруженном нами рестрикционном полиморфизме между M. musculus и M. caroli. Установлено, что в эмбриоидных тельцах всех исследованных гибридных клонов присутствуют транскрипты обоих родительских аллелей как локуса Xist, так и гена Gla. Не обнаружено признаков предпочтительной инактивации Х-хромосомы M. musculus или M. caroli в тестированных эмбриональных гибридных клетках, несмотря на первоначальные различия в онтогенетическом статусе между Х-хромосомами эмбриональных стволовых клеток и спленоцитов.
Ключевые слова: Х-хромосомы, инактивация Х-хромосом, эмбриональные стволовые клетки, эмбриональные гибридные клетки, дифференцировка.
Известно, что эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) обладают высокими проспективными потенциями и способны дифференцироваться как in vitro, так in vivo во все типы специализированных соматических клеток и гаметы (Hogan et al., 1994; Smith, 2001; Hubner et al., 2003; Toyooka et al., 2003; Geijsen et al., 2004). Потенциал ЭСК сохраняется в гибридных клетках, полученных слиянием ЭСК с клетками взрослого животного (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001, 2003; Cowan et al., 2005) или незрелыми гемопоэтическими и нейральными клетками (Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Do, Scholer, 2004). Более того, под влиянием генома ЭСК в гибридных клетках наблюдаются процессы репро-граммирования отдельных хромосом или всего генома, привнесенного дифференцированными клетками. Таким образом, эмбриональные гибридные клетки можно рассматривать как новый экспериментальный подход к восстановлению потенций дифференцированных клеток путем ре-программирования их генома (Matveeva et al.,
1998; Ambrosi, Rasmussen, 2005; Cowan et al., 2005). Однако репрограммирующая способность эмбриональных гибридных клеток недостаточно охарактеризована, и анализ ее ограничивается примерами реактивации отдельных генов генома дифференцированных клеток (Tada et al., 2001, 2003; Terada et al., 2002; Ying et al., 2002; Do, Scholer, 2004). Наше внимание привлекли сообщения об активном состоянии Х-хромосом в эмбриональных гибридных клетках, полученных путем слияния ЭСК генотипа XY с соматическими клетками генотипа XX или XY (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Kimura et al., 2002; Farivar et al., 2004). Известно, что гибридные клетки, так же как и ЭСК, способны образовывать in vitro эм-бриоидные тельца (ЭТ), в которых активно происходят процессы дифференцировки, включая инактивацию одной из Х-хромосом (Rastan, 1985; Matveeva et al., 1998; Wutz, Jaenisch, 2000; Farivar et al., 2004). Недавно мы описали хромосомный состав 20 гибридных клонов, полученных слиянием ЭСК M. musculus со спленоцитами M. caroli, большин-
206
ПУЗАКОВ и др.
ство из которых содержали Х-хромосомы обоих родительских видов (Пристяжнюк и др., 2005; Matveeva et al., 2005). Таким образом, появляется возможность исследовать экспрессию аллелей родительских Х-хромосом в условиях индуцированной in vitro дифференцировки. Такой подход позволяет выяснить, случайно или неслучайно происходит инактивация Х-хромосом, различавшихся своим онтогенетическим статусом до момента образования гибридных клеток. Представляется, что это более масштабный тест для оценки репрограммирования, поскольку инактивация оценивается, хотя и на уровне отдельных генов, но тем не менее характеризует состояние целой хромосомы. Уместно также подчеркнуть, что инактивация Х-хромосом у естественных гибридов F1, полученных от скрещивания M. musculus с M. caroli, осуществляется случайным образом (Chapman, Shows, 1976).
Наше сообщение посвящено анализу экспрессии генов Xist (кодирует специфический транскрипт неактивной Х-хромосомы) и Gla (кодирует а-галактозидазу) в условиях индуцированной in vitro дифференцировки эмбриональных гибридных клеток типа ЭСК M. musculus-сплено-цит M. caroli.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Культуры клеток. В работе использовали ЭСК M. musculus, линию НМ-1 (Magin et al., 1992) и 20 клонов гибридных клеток серии НМС, полученных слиянием клеток НМ-1 со спленоцитами взрослой самки M. caroli. Условия получения и культивирования гибридных клеток описаны ранее (Серов и др., 2003; Matveeva et al., 2005).
Идентификация Х-хромосом M. musculus и M. caroli в эмбриональных гибридных клетках. Идентификацию родительских Х-хромосом в гибридных клетках серии НМС проводили с помощью гибридизации in situ с использованием видо-специфичного ФИТЦ-меченного зонда pMSat5, который дает сильный сигнал над центромерами хромосом M. musculus, но не M. caroli (Пристяжнюк и др., 2005; Matveeva et al., 2005), и меченного дигоксигенином Х-хромосомоспецифичного зонда, "раскрашивающего" (painting) Х-хромосомы обоих видов. Биотинилирование видоспецифич-ного зонда pMSat5 и условия гибридизации in situ описаны ранее (Matveeva et al., 2005).
Сортировку и амплификацию сортированных хромосом мыши с помощью DOP-(degenerated oligonucleotide primer) полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили сотрудники Университета Кембриджа по методу, описанному ранее (Tele-nius et al., 1992; Yang et al., 2000). Конечным продуктом являлись так называемые DOP-библиоте-ки. Библиотека сортированных Х-хромосом мы-
ши была реамплифицирована с помощью ПЦР в 18 циклах. Условия реамплификации: 1 мкл DOP-библиотеки добавляли к 20 мкл ПЦР-смеси: 10 мМ mpuc-HCl, pH 8.3; 250 мкМ смеси нуклео-тидов дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ; 2 мкМ DOP-праймера; 2.5 мМ MgCl2 и 1.5 ед. Taq ДНК-поли-меразы. ПЦР проводили в режиме: денатурация 94°С - 1 мин; отжиг 56°С - 1 мин; элонгация цепей при 72°С - 2 мин и завершающая элонгация цепей при 72°С - 8 мин. Мечение библиотеки Х-хромосомы мыши проводили с помощью ПЦР, как описано выше, но использовали дТТФ и ди-гоксигенин-11-дУТФ в соотношении 2 : 1.
Х-хромосомоспецифичный зонд растворяли в гибридизационном буфере (2 мкл зонда и 15 мкл гибридизационного буфера на стекло). Денатурацию зонда производили при 95°C в течение 6 мин, затем при 37°C в течение 1 ч, а детекцию - смешиванием антидигоксигенин-родамина и ФИТЦ-авидина, после чего смесь наносили по 20 мкл на одно покровное стекло и инкубировали 40 мин во влажной камере при 37°C. Отмывали в 4 X SSC, содержащем 0.1%-ный Tween 20, три раза по 2 мин при 37°C. Обезвоживали последовательно в спиртах и высушивали при комнатной температуре. Хромосомы подкрашивали в растворе DAPI, отмывали в 2 X SSC, затем в воде. Препараты высушивали при комнатной температуре; под покровное стекло наносили по 5 мкл раствора анти-фейда.
Препараты анализировали на микроскопе Axioskop 2 ("К. ZEISS", Германия). Ввод цифровой информации производили с помощью CCD-камеры VC-44 (PCO). Изображение обрабатывали с помощью пакета прикладных программ ISIS3 (In situ Imaging System), "MetaSystems GmbH", Германия.
Получение ЭТ из гибридных клеток. Культуры гибридных клеток трипсинизировали (0.025%-ный трипсин, 0.037%-ный ЭДТА на фосфатном буфере в модификации Дульбекко, "Sigma", США) и суспендировали стандартным способом. Клеточную суспензию высевали на обработанные 1%-ной агарозой чашки в ростовую среду, не содержащую подавляющего дифференцировку фактора LIF. ЭТ формировались на 4-5-е сут культивирования, а на 9-12-е их анализировали (Robertson, 1987; Matveeva et al., 1998).
Выделение геномной ДНК и секвенирование фрагментов генов Xist и Gla M. caroli. ДНК гибридных клонов и родительских клеток выделяли с помощью DNAzol ("Life Technologies", США) согласно рекомендациям фирмы-производителя. Из тканей мышей линии 129/Ola и M. caroli ДНК выделяли фенол-хлороформным методом.
Фрагменты генов Xist и Gla M. caroli подвергали амплифицикации с помощью ПЦР. Реакцию проводили в реакционной смеси объемом 25 мкл,
Таблица 1. Условия проведения обратнотранскриптазной полимеразной цепной реакции генов Actb, Xist и Gla в эмбриональных стволовых и гибридных клетках
Ген Последовательность праймера Длина фрагмента, п.н. Концентрация MgCl2, мМ Температура отжига, °С
геномной ДНК кДНК
Actb 5'-ACGCACGATTTCCCTCTCAGC-3' 5'- GGCCCAGAGCAAGAGAGGTATCC-3' 913 459 2.0 58
Xist 5'- ATCT AAGAC AAAAT ACATCATTCCG-3' 5'- CTTGGACTTAGCTCAGGTTTTGTGTC-3' 250 250 3.0 55
Gla 5'- GTT C AT GCAGAT GGC AGAGC -3' 5'- CAGTGACAACCATCAAATTTTAGC-3' 1234 318 2.5 58
содержащей: ПЦР-буфер (65 мМ mpuc-Hd, рН 8.8; 16 мМ (NH4)2SO4 и 0.01%-ный Tween 20); от 2.0 до 3.0 мМ MgCl2; по 0.2 мМ каждого дезокси-нуклеотида (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ); по 1 мкМ прямого и обратного праймеров. Описание праймеров дано в табл. 1. В реакционную смесь затем добавляли 0.5 ед. Taq-полимеразы и 0.5-1.0 мкг геномной ДНК M. caroli. Условия проведения ПЦР на автоматическом амплификаторе PTC-100 ("MJ Research Inc.", США): денатурация ДНК при 95°С - 3 мин с последующей амплификацией (30
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.