научная статья по теме АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TLR2 И TLR4 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ДЕСТРУКТИВНЫМ ПАНКРЕАТИТОМ Биология

Текст научной статьи на тему «АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TLR2 И TLR4 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ДЕСТРУКТИВНЫМ ПАНКРЕАТИТОМ»

РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012, том 6(15), № 3, с. 281-288

ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ

АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ TLR2 И TLR4 В МОНОНУКЛЕАРНЫХ КЛЕТКАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ДЕСТРУКТИВНЫМ ПАНКРЕАТИТОМ

© 2012 г. М.В. Хорева, Л.В. Ковальчук, Н.В. Давыдова*, М.А. Агапов, В.А. Горский, И.В. Леоненко

Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова,

Москва, Россия;

*ФГБУ ФНКЦДетской гематологии, онкологии и иммунологии им. Д. Рогачева, Москва, Россия

Поступила: 14.05.2012. Принята: 20.08.2012

В настоящем исследовании проанализирована экспрессия мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 рецепторов в мононуклеарных клетках периферической крови больных острым деструктивным панкреатитом, получавших только стандартную терапию и больных, получавших комплексную терапию с включением лорноксикама — нестероидного противовоспалительного препарата группы оксикамов в динамике заболевания на 1, 3, 7 и 14-е сутки после госпитализации. Выявили, что уровень экспрессии мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4, определяемый с помощью ПЦР в режиме реального времени, у больных острым деструктивным панкреатитом повышен с 1-х по 14-е сутки. У больных с тяжелым течением острого деструктивного панкреатита уровень экспресии мРНК ТЬЯ2 выше, чем у больных со среднетяжелым течением. В группе больных, получавших лорноксикам, не выявили повышения экспрессии ТЬЯ2 на 3-и сутки, у больных этой группы происходит более выраженное снижение экспрессии ТЬЯ2 на 7-е сутки, к 14-м суткам различия в экспрессии мРНК ТЬЯ2 между пациентами двух групп становятся достоверными. На 1-е и 3-и сутки заболевания не обнаружено достоверного различия в экспрессии мРНК ТЬЯ4 между больными, получавшими стандартную терапию и больными, получавшими лорноксикам, к 7-м суткам у этих больных экспрессия мРНК ТЬЯ4 достоверно снижается по сравнению с больными, находящимися на стандартной терапии. Уровень экспрессии мРНК ТЬЯ4 в МНК периферической крови у больных с тяжелым и среднетяжелым течением достоверно не различался. Таким образом, применение лорноксикама на начальных этапах развития заболевания позволяет снизить экспрессию мРНК ТЬЯ2 и ТЬЯ4 и предотвратить развитие системной воспалительной реакции. Данные о состоянии ТЬЯ у больных острым деструктивным панкреатитом открывают новые перспективы в поиске маркеров диагностики, прогнозирования тяжести течения заболевания и в дальнейшем могут служить новой терапевтической мишенью в лечении больных острым деструктивным панкреатитом.

Ключевые слова: То11-подобные рецепторы, эндогенные лиганды, острый панкреатит, ингибитор циклооксигеназы

ВВЕДЕНИЕ

То11-подобные рецепторы (ТЬИ) относятся к семейству паттерн-распознающих рецепторов врожденного иммунитета. Они играют центральную роль в распознавании микробных патогенов клетками иммунной системы,

Адрес: 117997, Москва, ул. Островитянова, д. 1. E-mail: markhoreva@yandex.ru

однако распознавание лигандов только микробного происхождения не может объяснить все функции ТЬИ. В последние годы проводится все больше исследований, доказывающих, что эндогенные лиганды также активируют рецепторы врожденного иммунитета и запускают асептическое воспаление, которое развивается в ответ на травму, ишемию, массивное тканевое повреждение при отсутствии патогенной инфекции и сопровождается высокой выработкой провоспалительных

цитокинов [1 — 4]. Такие лиганды получили обозначение «сигналы опасности» или DAMP (damage-associated molecular pattern). К эндогенным активаторам TLR относятся белки теплового шока — HSP60, HSP70, фибронек-тин, гиалуроновая кислота и многие другие, высвобождающиеся в результате распада молекул внеклеточного матрикса, а также некроза клеток и массивной деструкции тканей [5, 6]. В физиологических концентрациях эндогенные лиганды способствуют процессам восстановления и заживления тканей, тогда как высвобождение эндогенных лигандов в избыточных количествах может привести к повреждению тканей.

Острый деструктивный панкреатит (ОДП) — локальное воспаление ткани поджелудочной железы, которое может быть результатом действия различных факторов: обструкции, гиперсекреции ацинарных клеток, ишемии и др. Тяжелый панкреатит сопровождается быстрым развитием системной воспалительной реакции и может привести к полиорганной недостаточности. Известно, что нарушения в иммунной системе, как в адаптивном иммунитете, так и во врожденном иммунитете играют ведущую роль в патогенезе острого панкреатита. Провоспалительные ци-токины, такие как IL-1, IL-6, IL-8 и TNFa, а также циклооксигеназа (ЦОГ) и другие медиаторы воспаления вносят существенный вклад в развитие воспаления при ОДП [7-10]. Другим важным компонентом, который участвует в развитии каскада воспалительных событий при ОДП, могут быть TLR [11]. Показано, что лиганды эндогенного происхождения, высвобождаемые при клеточной деструкции, такие как гепаран сульфат и панкреатическая эла-стаза могут активировать TLR, способствуя выбросу провоспалительных цитокинов при остром панкреатите [12]. Известно, что большинство эндогенных лигандов взаимодействуют с TLR2 и TLR4 [13]. На модели острого панкреатита у мышей показано, что экспрессия мРНК TLR4 повышена в поджелудочной железе на ранней стадии заболевания [14].

На кафедре иммунологии ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова в последние годы проводятся исследования по изучению роли TLR при острых патологических состояниях и разработана концепция комплексной оценки разных уровней функционирования системы TLR рецепторов. Мы выявили, что у больных ОДП значительно повышены эффекторные функции TLR4 и TLR1/2 рецепторов на моно-

нуклеарных клетках периферической крови, что может быть связано с их более высокой экспрессией клетками на начальной стадии заболевания. Использование лорноксика-ма — нестероидного противовоспалительного препарата группы оксикамов в комплексном лечении пациентов с ОДП приводило к снижению выработки провоспалительных цитокинов у этих больных [15].

В настоящем исследовании проанализирована экспрессия мРНК TLR2 и TLR4 рецепторов в мононуклеарных клетках периферической крови больных ОДП, получивших только стандартную терапию и больных, получивших комплексную терапию с включением лорноксикама.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проведено на кафедрах иммунологии и экспериментальной и клинической хирургии медико-биологического факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пи-рогова.

Пациенты

Обследовано 19 больных в возрасте от 20 до 60 лет с острым деструктивным панкреатитом (ОДП) токсической этиологии средней и тяжелой степени заболевания. Оценка степени тяжести проводилась по международной шкале APACHE II. Все пациенты получали стандартную терапию, предусмотренную протоколом ведения больных ОДП. Помимо нее, группе пациентов дополнительно проводилась терапия с использованием нестероидного противовоспалительного препарата лорноксикам. В

1-ю группу включены 10 пациентов, получающих только стандартную базисную терапию,

2-ю группу составили 9 пациентов, получающих комплексную терапию с добавлением лорноксикама. Периферическую кровь для исследования у больных забирали на 1, 3, 7 и 14 сутки после госпитализации.

Группу здоровых доноров составили 20 человек в возрасте 20 — 45 лет: 11 мужчин и 9 женщин. Донорская кровь была любезно предоставлена отделением переливания крови и гравитационной хирургии РДКБ.

Выделение мононуклеарных клеток (МНК) из периферической крови человека

МНК выделяли из гепаринизированной периферической крови (25 ед./1 мл крови)

здоровых доноров и больных ОДП в одноступенчатом градиенте плотности фиколл-уро-графина (Pharmacia, р = 1,077 г/см3). Рабочая концентрация клеток составляла 1*106 в 1 мл среды RPMI 1640 (Sigma), содержащей 5% сыворотки эмбрионов коров («HyClone, Perbio»), 2mM L-глутамина (НПП «ПанЭко»), антибиотик — 100 мкг/мл гентамицина (ОАО «Даль-химфарм», г. Хабаровск). Жизнеспособность клеток оценивали с помощью 0,1% раствора трипанового синего. Выделенные клетки хранили в растворе для стабилизации РНК «RNAlater RNA stabilization reagent» (Qiagen) при -70 °С.

Выделение РНК из мононуклеарных клеток периферической крови человека

Для выделения РНК из мононуклеарных клеток периферической крови человека использовали коммерческие наборы «RNeasy Plus Mini Kit» (Qiagen, США). Каждый образец содержал 1*106 клеток. Выделение проводилось в соответствии с инструкцией по применению наборов. Концентрацию выделенной из образцов РНК измеряли на спектрофотометре Picodrop (Thermo scientific, США). Концентрация РНК в образцах доноров и пациентов составила 16-80 нг/мкл. Рекомендуемая концентрация для проведения реакции обратной транскрипции от 1 пг/мкл до 1 мг/мкл.

Постановка реакции обратной транскрипции

Для проведения реакции обратной транскрипции использовали набор реагентов «High capacity RNA to cDNA Master mix» (Applied Biosystems, США). Равные количества РНК от здоровых доноров и пациентов с ОДП были использованы для проведения реакции обратной транскрипции. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 20 мкл на приборе Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР в режиме реального времени.

Постановка полимеразной цепной реакции

с детекцией в режиме реального времени, метод AACi

Анализ проводили на приборе Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System. Смесь

для реакции готовили по инструкции к реагентам «Taqman Gene Expression Master Mix», использовали набор праймеров для определения генов tlr2 (Hs01014511-m1, Applied Biosystems), tlr4 (Hs00152939-m1, Applied Biosystems). Реакционная смесь содержала 12,5 мкл «Taqman Gene Expression Master Mix», 1,25 мкл праймеров, 2,5мкл кДНК в общем объеме 25 мкл. Уровни экспрессии TLR нормировали по гену ß-актина (Human ACTB Endogenous Control (FAM/MGB Probe), Applied Biosystems,США). Режим для проведения реакции амплификации: 2 мин при t = 50 °С, 10 мин при t = 95 °С, 15 сек при t = 95 °С, 1 мин при t = 60 °С. Количество циклов 40. Расчет осуществлялся в программе к прибору Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System, версия 2.0.5. Метод AACt — это относительный метод измерения, при применении к

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком