МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 2, с. 251-264
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 57.088.1
АНАЛИЗ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ МНОЖЕСТВЕННОЙ И ШИРОКОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ТУБЕРКУЛЕЗА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОЛИГОНУКЛЕОТИДНОГО МИКРОЧИПА
© 2014 г. Д. В. Зименков1*, Е. В. Кулагина1, О. В. Антонова1, С. А. Суржиков1, Ю. А. Беспятых2, Е. А. Шитиков2, Е. Н. Ильина2, В. М. Михайлович1, А. С. Заседателев1,3, Д. А. Грядунов1
Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, Москва 119991 2Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства, Москва, 119435 3Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный, Московская обл., 141700 Поступила в редакцию 12.07.2013 г. Принята к печати 04.09.2013 г.
Уровень лекарственной устойчивости возбудителя туберкулеза неуклонно повышается, что приводит к необходимости разрабатывать и внедрять новые быстрые диагностические тесты для выявления в геномной ДНК детерминант устойчивости к максимально большему числу противотуберкулезных препаратов. В работе представлен метод анализа последовательностей фрагмента гена rpoB (мутации в котором влияют на восприимчивость туберкулезных микобактерий к рифампицину), фрагментов генов katG, inhA, ahpС (приводят к устойчивости к изониазиду), двух областей генов gyrA и gyrB (приводят к устойчивости к фторхинолонам), а также анализа мутаций, ассоциированных с устойчивостью к канамицину, капреомицину и амикацину, в гене rrs и в промоторной последовательности гена eis. Олигонуклеотид-ный микрочип — ключевой компонент разработанного подхода — позволяет идентифицировать, суммарно, 99 мутаций, а формат анализа "один образец — одна стадия ПЦР — один биочип" позволяет за один день выявлять возбудителей туберкулеза со множественной и широкой лекарственной устойчивостью. С использованием разработанного подхода проведен анализ 63 штаммов Mycobacterium tuberculosis, характеризующихся разными профилями лекарственной устойчивости, и определен спектр мутаций, встречающихся в штаммах возбудителя туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью и с широкой лекарственной устойчивостью. Приведена оценка диагностической значимости включения дополнительных генетических локусов при определении устойчивости микобактерий.
Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, множественная и широкая лекарственная устойчивость, мультиплексная ПЦР, гибридизация, олигонуклеотидный микрочип.
ANALYSIS OF GENETIC DETERMINANTS OF MULTIDRUG AND EXTENSIVELY DRUG-RESISTANT MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS USING OLIGONUCLEOTIDE MICROCHIP, bv
D. V. Zimenkov1*, E. V. Kulagina1, O. V. Antonova1, S. A. Surzhikov1, J. A. Bespyatykh2, E. A. Shitikov2,
E. N. Ilina 2, V. M. Mikhailovich1, A. S. Zasedatelev1,3, D. A. Gryadunov1 (1Engelhard Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991 Russia, *e-mail: z@biochip.ru; 2Scientific Research Institute of Physico-Chemical Medicine, Federal Medical and Biological Agency, Moscow, 119435 Russia; 3Moscow Institute of Physics and Technology (State University), Dolgoprudniy, Moscow region, 141700 Russia ). Steadily growing resistance of the tuberculosis causative agent towards a broad spectrum of anti-tuberculosis drugs calls for rapid and reliable methods for identifying the genetic determinants responsible for this resistance. In this study, we present a biochip-based method for simultaneous identification of mutations within rpoB gene associated with rifampin resistance, mutations in katG, inhA, ahpC genes responsible for isoniazid resistance, mutations within the regions of gyrA and gyrB genes leading to fluoroquinolones resistance, and mutations in the rrs gene and the eis promoter region associated with the resistance to kanamycin, capreomycin and amikacin. The oligonucleotide microchip, as the core element of this assay, provides simultaneous identification of 99 mutations in
Принятые сокращения: ТБ — туберкулез; МЛУ-ТБ — туберкулез с множественной лекарственной устойчивостью; ШЛУ-ТБ — туберкулез с широкой лекарственной устойчивостью.
* Эл. почта: z@biochip.ru.
the format "one sample — one PCR — one microchip", and it makes it possible to complete analysis of multi-drug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis within a single day. The tests on 63 Mycobacterium tuberculosis clinical isolates with different resistance profiles using the developed approach allows us to reveal the spectrum of drug-resistance associated mutations, and to estimate the significance of the inclusion of extra genetic loci in the determination of M. tuberculosis drug resistance.
Keywords: Mycobacterium tuberculosis, multidrug and extensively drug-resistance, multiplex PCR, hybridization, oligonucleotide microchip.
DOI: 10.7868/S0026898414020189
Туберкулез остается крайне актуальной проблемой здравоохранения. В 2011 г. Всемирной организацией здравоохранения зарегистрировано около 9 млн. новых случаев туберкулеза и 1.4 млн. смертей от этого заболевания [1]. Ситуация осложняется тем, что число штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к противотуберкулезным препаратам, неуклонно растет. Среди них выделяют возбудителей туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ-ТБ, MDR TB), с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ-ТБ, XDR TB) и возбудителей с полной невосприимчивостью ко всем известным противотуберкулезным препаратам (суперустойчивый ТБ, XXDR TB). Микобакте-рии, возбудители МЛУ-ТБ, устойчивы, по крайней мере, к двум наиболее эффективным препаратам первого ряда - изониазиду и рифампицину. ШЛУ-ТБ — это форма туберкулеза, возбудитель которого устойчив к этим двум, а также к одному из препаратов фторхинолонового ряда и как минимум к одному из трех инъекционных противотуберкулезных препаратов второй линии терапии — амикацину, ка-намицину или капреомицину [2, 3].
В России, по данным официальной статистики, в 2011 г. доля МЛУ-ТБ среди впервые выявленных больных составила 19.4%. В пенитенциарной системе этот показатель еще выше — 23.8%. Данные по изучению ШЛУ-ТБ в России не публикуются, поскольку они не включены в отчетные формы [4], однако, по сообщению ВОЗ, его доля составляет около 30% от МЛУ-ТБ. В мире число случаев ШЛУ-ТБ достигает 25000 в год, и почти все они приводят к смертельному исходу [5].
Лекарственно-устойчивые формы болезни не поддаются терапии противотуберкулезными средствами первой линии и лечатся препаратами второй и третьей линий, которые, в целом, менее эффективны, более токсичны и дороги. Сведения об абсолютных цифрах затрат на курс лечения пациента, больного туберкулезом, в России, к сожалению, недоступны, однако соотношение стоимости курсов лечения различных форм туберкулеза можно оценить из опубликованных данных по Южной Африке: затраты составляют $247, $6772 и $26392 — для чувствительного туберкулеза, для МЛУ- и ШЛУ-ТБ соответственно [6]. Лечение устойчивых форм ту-
беркулеза более длительно, при том, что эффективность лечения, по сравнению с эффективностью лечения чувствительных форм, ниже. Распространение устойчивых форм туберкулеза ставит задачу как можно более ранней диагностики, что необходимо для эффективного лечения пациентов и предотвращения внутрибольничной трансмиссии опасных штаммов.
Для выявления маркеров МЛУ-ТБ предложено несколько быстрых молекулярно-генетических методов с чувствительностью и специфичностью выше 90% [7], но возможности диагностических тестов для идентификации генетических детерминант ШЛУ-ТБ пока весьма ограничены. Разработанные к настоящему времени молекулярно-генетические методы либо не выявляют все известные сейчас генетические детерминанты устойчивости [8], либо настолько дороги (например, методы с использованием секвенирования [9] и пиросеквенирования [10]), что пока не могут применяться для массового скрининга в условиях клинической лаборатории. Возможности предлагаемых коммерческих наборов сводятся к определению мутаций в гене gyrA, ответственных за устойчивость к фторхинолонам, а также мутацию в позиции 1401 гена rrs — для определения устойчивости к канамицину, амикацину и капрео-мицину. Чувствительность методик в этом случае составляет, примерно, 82% для фторхинолонов, 58, 55 и 90% — для канамицина, амикацина и капреомицина соответственно [7].
Чтобы повысить чувствительность анализа устойчивости к фторхинолонам, необходимо определять также как минимум (помимо мутаций гена gyrA) пять мутаций в гене gyrB, которые обнаружены в клинических образцах. Как установлено ранее, они ослабляют ингибирование фторхинолона-ми функции ДНК-гиразы in vitro, что свидетельствует об их участии в формировании устойчивости у M. tuberculosis [11].
Чувствительность к канамицину можно повысить от 58 до 87% за счет включения в диагностическую систему локуса eis [12]. Однако в другом случае, добавление в систему локуса гена tlyA, участие которого в формировании устойчивости подтверждено [13], не приводит к существенному повышению чувствительности (только до 61%).
Эти мутации редко встречаются в клинических образцах, а их распределение по всей длине открытой рамки считывания затрудняет создание генетических тестов.
Отечественные наборы реагентов "ТБ-Био-чип-1" и "ТБ-БИОЧИП-2", которые основаны на гибридизации флуоресцентно-меченых ПЦР-про-дуктов с олигонуклеотидами, иммобилизованными в гидрогелевых элементах биологического микрочипа, успешно применяются в Российской Федерации и странах ближнего зарубежья для выявления ДНК микобактерий туберкулеза и для определения устойчивости к рифампицину/изониазиду и фторх-инолонам [14]. Описан также метод одновременного определения устойчивости к фторхинолонам, иньекционным аминогликозидам и капреомицину [15], включающий в себя анализ большего числа мутаций в генах gyrA, gyrB, eis, rrs.
В настоящей публикации представлен метод, позволяющий одновременно определять генетические детерминанты множественной и широкой лекарственной устойчивости M. tuberculosis в течение одного дня. Метод основан на многоп
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.