Естествознание
УДК 611.013
Полина Юрьевна Поварницына, аспирант Алефтина Николаевна Голубица,
научный сотрудник Антонина Ивановна Железова,
научный сотрудник
Елена Александровна Кизилова,
кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск, Россия pinus@bionet. nsc. ru
АНАЛИЗ ХИМЕР, ПОЛУЧЕННЫХ АГРЕГАЦИЕЙ ЭМБРИОНОВ И ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК РАЗНОЙ ПЛОИДНОСТИ
Изучено развитие химер мыши, полученных агрегацией диплоидных (2n) и тетраплоидных (4n) эмбрионов с диплоидными (2n) и тетраплоидными (4n) эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК). Показано, что раннее развитие химерных бластоцист, в целом, мало зависит от плоидности партнёров по агрегации. Однако после имплантации определяющим фактором в развитии химер является потенциал эмбрионального партнера, который зависит от плоидности.
Ключевые слова: эмбрион, бластоциста, химера, ЭСК, 2n/4n-плоидность,
GFP.
Введение. В настоящее время особое внимание уделяется получению химер у млекопитающих. Эта область исследований до сих пор полна загадок и является зоной пристального интереса эмбриологов и генетиков развития. С одной стороны, показано, что при использовании теста тетраплоидной комплементации (TEC) 4n клетки формируют только экстраэмбриональную часть, а все органы и ткани эмбриона развиваются из клеток диплоидного партнера (Nagy et al., 1990). С другой стороны, in vivo проверка плюрипотентности клеточных гибридов, полученных слиянием ЭСК и соматических клеток и имеющих, как правило, тетрапло-идный кариотип, показала, что тетраплоидные клетки дают большой вклад в органы и ткани химер (Kruglova et al., 2008).
Целью работы было углубленное исследование феномена 4n/2n химериз-ма у мыши. Для этого мы конструировали химер в разных сочетаниях плоидности партнёров (1) и далее изучали развитие и колонизацию химерных эмбрионов в условиях in vitro (2а) и in vivo (2b).
Объекты, материалы и методы. Все эксперименты выполнены на мышах C57BL/J6, содержавшихся в виварии ИЦиГ СО РАН (Новосибирск) при естественном освещении и спаривании без гормональной стимуляции. Все манипуляции с эмбрионами проводили согласно конвенциональным протоколам (Nagy, Rossant, 1993) в стандартных средах (Sigma-Aldrich inc., USA; Millipore, USA). 4n-эмбрионы получали методом электрослияния бластомеров 2-кл 2п-эм6риош на приборе «ECM 2001» (BTX, Harvard, USA). В работе использованы 2п-ЭСК линия
TgTP6.3 (Pratt et al, 2000) и 4п-ЭСК клоны D3T-7 и D3T-14 (Matveeva et al, 2005). Все линии имели стабильную конститутивную экспрессию GFP. Химерные бла-стоцисты использовали для прижизненного наблюдения и приготовления препаратов (2а), либо трансплантировали реципиентам (2b) генотипа F1: jC57Black/J6 x ^CBA, покрытым вазэктомированными самцами ICR. Микроскопирование, получение и анализ изображений проведены на базе ЦКП МАБО ИЦиГ СО РАН (http://www.bionet.nsc.ru/microscopy/index.html).
Результаты
1. Конструирование химер. Химерные эмбрионы были получены в 4 комбинациях плоидности партнеров: 2п-эмбрион^4п-ЭСК (вариант 2n-^4n), 4n-эмбрион^2п-ЭСК (вариант 4n-^2n, ТЕС-тест), 4п-эмбрион^4п-ЭСК (вариант 4n^4n, ТЕС-тест), 2п-эмбрион^2п-ЭСК (вариант 2n^2n, контроль).
2a. Исследование химерных эмбрионов в условиях in vitro.
Эффективность культивирования эмбрионов в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч практически не зависит от использованных сред (M16 и KSOM). Анализ колонизации герминального и трофобластического зачатков потомками GFP-маркированных клеток представлен в Табл. 1. Бластоцисты всех опытных групп морфологически не отличались от контроля. Уменьшение ВКМ в группе 4n^4n химер является ожидаемым эффектом - он был описан ранее для полностью тет-раплоидных эмбрионов (Eakin et al., 2005). Как показали прижизненные наблюдения и последующий анализ, проведённый с использованием флуоресцентной и лазерной конфокальной микроскопии, практически все химерные бластоцисты имели в своем составе GFP-маркированные ЭСК. Снижение доли бластоцист с GFP-сигналом в ВКМ отмечено только для группы 4n^4n химер. Маркированные клетки были отмечены также и в трофобласте (спорадически). Частота колонизации трофобласта максимальна в группе 4n^4n химер. Отсутствие колонизации трофобласта в группе 4n-^2n требует дальнейшей проверки.
Таблица 1
Колонизация химерных бластоцист_
Варианты: 2n^2n 2n^4n 4n^2n 4n^4n
Получено бластоцист: 25 75 37 30
Морфология бластоцист: норма норма норма уменьшение ВКМ
Заселение внутренней клеточной массы (ВКМ):
- число бластоцист, 25 (100%) 64 (85%) 37 (100%) 30 (100%)
имеющих GFP-сигнал
в ВКМ (%%)
- характер заселения полностью полностью полностью полностью
ВКМ
Заселение трофобласта:
- число бластоцист, 2 (8%) 5 (7%) 0 13 (44%)
имеющих GFP-сигнал
(%%)
- характер заселения 1-2 клетки 1-4 клетки 0 1-5 клеток
трофобласта:
2. Исследование химерных эмбрионов в условиях in vivo.
После трансплантации бластоцист во всех вариантах, кроме 4n^4n, были получены химерные эмбрионы с сильным вкладом меченых клеток в эмбриональные и экстраэмбриональные ткани. Эффективность имплантации химерных эмбрионов (Табл.2) определялась на сроке 10-13 dpc (days post coitum) как доля мест имплантации от общего числа трансплантированных эмбрионов. Этот показатель составил 11% и 12,2% для групп 2n-^2n и 2n^4n, 2% и 2,8% для групп 4n^2n и 4n^4n соответственно. Наблюдаемые различия между группами с эмбриональным партнером 2n и 4n достоверны (p<0,05) и не зависят от плоидности ЭСК.
Таблица 2
Результаты трансплантации химерных эмбрионов_
Варианты: 2n^2n 2n^4n 4n^2n 4n^4n
Трансплантировано бластоцист: 73 205 215 72
Реципиентов: 11 25 25 7
Беременностей: 4 11 3 2
Мест имплантации 8 25 5 2
(эффективность имплантации, (11%) (12,2% ) (2%) (2,8%)
%):
Живых эмбрионов:
GFP-сигнал присутствует (+) 1(+) 2(+) 2(+) 0(+)
GFP-сигнал отсутствует (-) 1(-) 6(-) 0(-) 0(-)
Погибших эмбрионов:
GFP-сигнал присутствует (+) 3(+) 6(+) 2(+) 0(+)
GFP-сигнал отсутствует (-) 3(-) 11(-) 1(-) 2 (-)
Обсуждение. Ранее в качестве 4n клеточного партнера использовались гибриды ЭСК и соматических клеток (Kruglova et al., 2008). Для данной работы были выбраны два клона 4п-ЭСК (D3T-7 и D3T-14), полученные слиянием плю-рипотентных ЭСК (Matveeva et al., 2005). Использование этих клонов исключало влияние процессов репрограммирования на потенциал 4п-ЭСК. Результаты, полученные в экспериментах in vitro, позволяют говорить о том, что 4п-ЭСК дают вклад в ВКМ в бластоцистах всех исследованных групп. Таким образом, как минимум, в условиях нашего эксперимента, заселение ВКМ не зависело ни от плоидности эмбрионального, ни от плоидности клеточного партнёров по агрегации.
Результаты, полученные на новой модели 4n^4n химерных эмбрионов, позволили оценить взаимодействие двух популяций 4п-клеток, имеющих разное происхождение и потенциал к развитию. Клетки тетраплоидного эмбрионального партнера, имеющие ограниченный потенциал к развитию в эмбриональные ткани, формировали производные трофобласта, а большинство 4п-ЭСК, согласно своему происхождению, практически полностью формировали ВКМ. Это позволяет говорить о некоторой «инерционности» предимплантационного развития химерных эмбрионов мыши и его независимости от плоидности клеток эмбриона. Однако, после имплантации развитие химерных эмбрионов зависит как от плоидности эмбрионального партнера, так и от плюрипотентности самих ЭСК.
Заключение. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что 4п-ЭСК в целом сохраняют свое свойство заселять ВКМ. Их плоидность не является фактором, определяющим исход развития (developmental fate) химерного
эмбриона в предимплантационный период. В постимплантационный период у изученных агрегационных химер (2n^2n, 2n-^4n, 4n-^2n и 4n^4n) определяющим является потенциал к развитию эмбрионального партнера, который напрямую зависит от его плоидности.
Работа поддержана грантом РФФИ (09-04-01369-a) и грантом Carl Zeiss
(2009).
Список использованных источников и литературы
1. Eakin, G.S., Hadjantonakis, A.-K., Papaioannou, V.E., Behringer, R.R. Developmental potential and behavior of tetraploid cells in the mouse embryo // Dev. Biol. - 2005. - V. 288. - P. 150-159.
2. Kruglova, A.A., Kizilova, E.A., Zhelezova, A.I., Gridina, M.M., Golubitsa, A.N., Serov, O.L. Embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. - 2008. - V. 334. - P. 371380.
3. Matveeva, N.M., Pristyazhnyuk, I.E., Temirova, S.A., Menzorov, A.G., Va-silkova, A.A., Shilov, A.G., Smith, A., Serov, O.L. Unequal segregation of parental chromosomes in embryonic stem cell hybrids // Mol. Reprod. Dev. - 2005. - V. 71. - P. 305-314.
4. Nagy, A., Gocza, E., Diaz, E.M., Prideaux, V.R., Ivany, M., Markkula, M., Rossant, J. Embryonic stem cells alone are able to support fetal development in the mouse // Development. - 1990. - V. 110. - P. 815-821.
5. Nagy, A., Rossant, J. Production of completely ES-derived fetuses // Gene Targeting: a Practical Approach / Ed. Joyner, A. - Oxford: IRL Press, 1993. - P. 147179.
6. Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D.J., Mason, J.O. Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein // Dev. Biol. - 2000. - V. 228. - P. 19-28.
UDC 611.013
P. Yu. Povarnitcyna, A.N. Golubitsa, A.I Zhelezova, E.A. Kizilova
Institute of Cytology and Genetics SB RAS, Novosibirsk, Russia pinus@bionet. nsc. ru
IN VITRO AND IN VIVO ANALYSIS OF MICE CHIMAERAS PRODUCED BY AGGREGATION OF BLASTOMERES WITH 2N- OR 4N-ES CELLS
Chimaeric mice blastocysts were produced using aggregation of diploid (2n) and tetraploid (4n) blastomeres with diploid (2n) and tetraploid (4n) embryonic stem cells (ES cells). Chimaeric embryos developed normally in vitro up to blastocyst stage despite of aggregating partner's ploidy. However postimplantation development of chi-maeras in vivo depended on the ploidy of embryo more than the ES cells ploidy.
Keywords: embryo, blastocyst, chimaera, ES ce
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.