МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2011, том 45, № 5, с. 840-844
ГЕНОМИКА. ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.2:616.006
АНАЛИЗ ХИМЕРНЫХ ОНКОГЕНОВ SYT/SSX1 И SYT/SSX2 ПРИ СИНОВИАЛЬНОЙ САРКОМЕ
© 2011 г. Т. В. Кекеева1' 2*, А. А. Рязанцева1, Л. Э. Завалишина1, Ю. Ю. Андреева1, О. В. Бабенко2, Д. В. Залетаев2, Г. А. Франк1
Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена Росмедтехнологий, Москва, 125284 Научно-исследовательский институт молекулярной медицины Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва, 119992
Поступила в редакцию 30.11.2010 г.
Принята к печати 02.02.2011 г.
Для синовиальной саркомы (СС) характерно наличие хромосомной транслокации t(X;18)(p11;q11), в результате которой происходит слияние гена SYTс одним из генов — членов семейства SSX: SSX1, SSX2 или SSX4 — с образованием нового химерного онкогена SYT/SSX. Нами проведен анализ экспрессии химерных онкогенов SYT/SSX1 и SYT/SSX2 в образцах парафиновых блоков СС и сравнение диагностической значимости иммуногистохимического, цитогенетического и молекулярно-генетического методов выявления СС. Химерные транскрипты обнаружены в 12 из 16 случаев опухолей: семь химерных тран-скриптов SYT/SSX1, пять вариантов SYT/SSX2. Транслокация t(X;18)(p11;q11) выявлена методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) в 13 из 16 случаев. Полученные результаты свидетельствуют о том, что генетический анализ транслокаций t(X;18)(p11;q11) и соответствующих химерных генов SYT/SSX1 и SYT/SSX2 представляет собой эффективный метод диагностики СС, чувствительность которого превосходит чувствительность методов с использованием иммуногистохимических маркеров.
Ключевые слова: синовиальная саркома, транслокация, химерный онкоген.
ANALYSIS OF SYT/SSX1 AND SYT/SSX2 FUSION GENES FROM SYNOVIAL SARCOMA, by T. V. Kekeeva1'2*, A. A. Ryazantseva1, L. E. Zavalishina1, Y. Y. Andreeva1, O. V. Babenko2, D. V. Zaletaev2, G. A. Frank1 (1Herzen Moscow Oncology Research Institute, Moscow, 125284 Russia; 2Institute of Molecular Medicine, Sechenov Moscow Medical Academy, Moscow, 119992 Russia, *e-mail: kekeeva@mail.ru). The t(X;18)(p11;q11) translocation has been shown to be the specific alteration for synovial sarcomas. The translocation leads to production of chimeric protein SYT/SSX by fusion of SYT and SSX genes involved. The expression analysis of SYT/SSX1 and SYT/SSX2 chimeric transcripts was performed in formalin-fixed soft tissue tumour specimens and the diagnostic validity of immunohistochemistry, FISH and RT-PCR methods was compared. The chimeric transcripts were detected in 12 from 16 synovial sarcomas: 7 SYT/SSX1 and 5 SYT/SSX2 fusion variants; by fluorescence hybridization in situ (FISH) the translocation was found in 13 from 16 sarcoma samples. As synovial sarcoma represents a diagnostically challenging group, genetic analysis of translocations and chimeric transcripts is an extremely useful confirmatory diagnostic tool providing higher sensitivity than immunohistochemistry markers do.
Keywords: synovial sarcoma, translocation, fusion gene.
Синовиальная саркома (СС) — злокачественная опухоль мягких тканей, встречающаяся в 5—10% случаев сарком; локализуется преимущественно на конечностях, около крупных суставов, сухожилий, синовиальных сумок, реже — в области головы, шеи, на стенке живота или в любом из внутренних органов. Чаще встречается у мужчин, причем преимущественно в возрасте от 15 до 35 лет.
Тип клеток, из которых происходит СС, остается предметом дискуссий, хотя показано, что такие опухолевые клетки имеют признаки эпителиальной дифференцировки [1, 2]. Профиль экспрессии клеток СС сходен с таковым у стволовых клеток нервного гребня [3]. Возможность индукции экспериментальной модели СС в миобластах трансгенных мышей позволяет также предположить, что пред-
Принятые сокращения: FISH — флуоресцентная гибридизация in situ; СС — синовиальная саркома; БСС — бифазная СС; MCC — монофазная CC; ОЦК — общий цитокератин; ЭМА — эпителиальный мембранный антиген.
* Эл. почта: kekeeva@mail.ru
шественником могут быть незрелые миобласты [4]. В настоящее время принято считать, что СС происходит из мультипотентных стволовых клеток, которые способны дифференцироваться как в эпителиальном, так и в мезенхимальном направлении.
Гистологически выделяют бифазную и монофазную СС (БСС и МСС соответственно). Для БСС характерно сочетание веретеноклеточного и эпителиального компонента с формированием железисто-подобных структур, в то время как МСС представлена только веретеноклеточным компонентом. Как и большинство других опухолей мягких тканей, диагностировать СС, опираясь исключительно на гистологические и клинические критерии, сложно. В некоторых случаях только сочетание нескольких методов исследования: на уровне ультраструктуры, иммуногистохимического и молеку-лярно-генетического анализа — дает возможность определить тип саркомы. Это особенно относится к МСС, дифференциальную диагностику которой проводят с фибросаркомой, лейомиосаркомой, злокачественной опухолью оболочек периферических нервов, злокачественной фиброзной гистио-цитомой. Такие иммуногистохимические маркеры, как эпителиальный мембранный антиген (ЭМА), общий цитокератин (ОЦК), CD99 и 8100, не считаются специфичными для СС и встречаются в данной саркоме с частотой 90, 60, 60 и 30% соответственно.
В настоящее время единственной достоверной характеристикой СС считается хромосомная транслокация 1(Х;18)(р11;д11), частота определения которой составляет 95—98% [5—8]. В результате транслокации происходит слияние гена 8УТ с одним из генов-членов семейства 88Х 88X1, или ББХ4 — с образованием нового химерного онкогена БУТ/ББХ, белковый продукт экспрессии которого, 8УГ/88Х, играет важную роль в формировании опухолевого фенотипа СС [9].
В данной работе представлены результаты впервые проведенного в России анализа экспрессии химерных онкогенов 8УТ/88Х1 и 8УТ/88Х2 в образцах парафиновых блоков СС с оценкой частоты характерных для СС изменений с использованием имму-ногистохимических, цитогенетических и молеку-лярно-генетических методов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использован операционный материал, полученный из патологоанатомического отделения Московского научно-исследовательского онкологического института им. П.А. Герцена, от 16 больных с диагнозом синовиальная саркома (12 БСС и 4 МСС) и 17 больных с другими опухолями мягких тканей (нейросаркома, фибросаркома, злокачественная фиброзная гистиоцитома, хондросарко-ма, злокачественная опухоль из оболочек перифе-
рических нервов, ангиосаркома, периваскулярная эпителиоидная опухоль, липома, хондрома, не-классифицируемые саркомы). Материал фиксировали 10%-ным раствором нейтрального формалина в течение 24 ч, обезвоживали, заливали в парафин. Готовили срезы толщиной 4—5 мкм, депарафиниро-вали и окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином.
РНК из парафиновых блоков выделяли с использованием набора "RNeasy FFPE Kit" ("Qiagen", Германия) согласно протоколу фирмы-производителя. Обратную транскрипцию РНК проводили методом случайного праймирования с использованием High-Capacity cDNA Archive kit ("Applied Biosystems", США) по протоколу фирмы-производителя в термоциклере ("ДНК-технология", Россия) по следующей температурной схеме: 20 мин при 60°С, 120 мин при 37°С. Образцы кДНК хранили при температуре —20°С.
Целостность и количество выделенной РНК оценивали по экспрессии гена GAPD. Экспрессию химерных генов SYT/SSX1 и SYT/SSX2 анализировали с помощью праймеров, последовательность которых описана ранее [10]. ПЦР проводили по следующей схеме: к 0.1 мкг геномной ДНК добавляли 0.05 мкмоль каждого олигопраймера, 200 мкмоль каждого dNTPs, 1—2 ед. Taq-полимеразы, 5 мкл буфера для ПЦР следующего состава: 50 мМ KCl, 10 мМ Трис-HCl (pH 8.4), 5 мМ MgCl2. Затем добавляли 30 мкл вазелинового масла, прогревали смесь при 95°С в течение 10 мин и проводили 33 цикла по следующей программе: денатурация при 95°С в течение 30 с, отжиг и элонгация при 60°С в течение 2 мин 30 с. Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в 6%-ном денатурирующем ПААГ который затем окрашивали нитратом серебра. Секвенирова-ние проводили по протоколам ABI Prism 310 Genetic Analyzer Kits ('Applied Biosystems"); для анализа хроматограмм секвенированных последовательностей использовали программы Chromas.
Компьютерный анализ кДНК проводили с использованием баз данных Blast и Blat.
Непосредственно перед проведением флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) депарафини-рованные срезы инкубировали в течение 10 мин при 80°С в 1 М растворе NaSCN, затем в течение 15 мин при 37°С с протеазой (2500—3000 ед./мл) в 0.2 N растворе HCl ("Vysis", США); после чего срезы дегидратировали и высушивали при комнатной температуре. На срезы наносили коммерческий зонд ("Vysis") LSI SYT Dual Color Breakapart Probe (локус 12q13) и проводили гибридизацию по программе: денатурация при 73°С в течение 5 мин, гибридизация при 37°С в течение ночи. Срезы отмывали дважды в SSC (Na-цитратном буфере), pH 7.0, содержащем 0.1% Nonidet NP-40, при 73°С в течение 2 мин, затем высушивали на воздухе и заключали в среду с красителем DAPI. Детекцию проводили
Результаты иммуногистохимического, молекулярно-генетического (мРНК генов GAPD и SYT/SSX) и FISH анализов образцов синовиальных сарком
Номер Возраст Пол Локализация Тип ИГХ-маркерыа мРНК геновб fish6
GAPD SYT/SSX
1 42 м предплечье БСС ОЦК, S100 + - -
2 16 м ротоглотка БСС ЭМА, ОЦК + SYT/SSX1 +
3 60 м кости таза БСС - + SYT/SSX1 +
4 36 ж грудная клетка БСС S100 + SYT/SSX1 +
5 22 ж стопа БСС ЭМА, ОЦК + SYT/SSX1 +
6 50 ж коленный сустав БСС ЭМА, ОЦК + SYT/SSX1 +
7 77 ж голень БСС S100 + - +
8 24 м коленный сустав БСС * + SYT/SSX1 +
9 29 ж подколенная область МСС - + SYT/SSX2 -
10 23 ж стопа БСС ЭМА + SYT/SSX1 -
11 34 м забрюшинно БСС ОЦК + - +
12 65 м средостение МСС - - - +
13 48 м предплечье БСС ЭМА, CD99 + SYT/SSX2 +
14 25 ж локтевая ямка БСС ЭМА, ОЦК + SYT/SSX2 +
15 35 м плечевой сустав МСС ЭМА, ОЦК, NS
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.