ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.17:597.553.2
АНАЛИЗ ИЗМЕНЧИВОСТИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ У КАМЧАТСКОЙ МИКИЖИ (Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss)
© 2011 г. С. Д. Павлов1, А. В. Семенова1, 3, Г. А. Рубцова2, К. И. Афанасьев2
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, кафедра ихтиологии, Москва 119991
e-mail: serge_javlov@mail.ru 2Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва 119991
e-mail: afanasiev@vigg.ru
3Учреждение Российской академии наук Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Москва 119071
Поступила в редакцию 01.02.2011 г.
Исследовано генетическое разнообразие камчатской микижи Parasalmo (O.) mykiss по 10 локусам мик-росателлитной ДНК, проведено филогеографическое сравнение с другими представителями вида на ареале. Показано, что камчатские популяции отличаются от других географических групп микижи по ряду микросателлитных локусов, имеют четкую кластеризацию, характеризуются более низкими оценками генетического разнообразия. Анализ совокупности из 26 различных микросателлитных локусов (собственные и литературные данные) показал, что внутри камчатского региона большинство популяций обособлено друг от друга, имеют выраженную географическую дифференциацию и приуроченность к определенным речным бассейнам. С высоким уровнем вероятности выделяются три географических кластера (северо-западный, юго-западный, восточный) камчатской микижи. В целом исследования микросателлитной ДНК подтверждают данные об относительно низком уровне генетического разнообразия камчатской группы Parasalmo (O.) mykiss, полученные по оценкам изменчивости отдельных генов ядерной, митохондриальной ДНК и аллозимных локусов.
Камчатская микижа (Рага^а1то (О.) шукш) является сложнокомплексным высокоадаптивным видом, на примере которого активно исследуются генетические и микроэволюционные процессы в популяциях лососевых рыб. Этот вид демонстрирует различные жизненные стратегии, представленные разнообразными эпигенетическими вариациями (морфоэкологическими формами, экоформами), в пределах одной популяции и на ареале в целом [1]. Так, локальные популяции микижи могут состоять из одной или нескольких в разной степени взаимосвязанных экоформ, определяемых различными жизненными стратегиями:
анадромной, типично проходной, сразу после ската из рек уходящей далеко на нагул;
анадромной, проходной, включающей стадию так называемого "полуфунтовика", смолты которой после ската проводят в море несколько месяцев, возвращаются на зимовку обратно в реки и лишь следующей весной, скатившись в море, уходят на нагул;
эстуарной, речной-эстуарной, совершающей миграции (обычно нагульные, сезонные) в эстуарий реки;
резидентных, жилых (речной, озерно-речной и озерной).
Соотношение внутривидовых форм и разнообразие фенотипов с различной жизненной стратегией неодинаково в разных участках ареала вида и
определяется в значительной мере конкретными условиями обитания [1—3].
Высокая промысловая ценность проходной формы вида и успешность искусственного разведения жилой формы делают популяционно-генетиче-ские исследования особенно актуальными. Несмотря на широкое распространение микижи, генетические исследования природных популяций, обитающих на азиатской части ареала (Камчатский полуостров), начаты сравнительно недавно [1, 4—9]. Современное состояние исследований генетического разнообразия микижи демонстрирует неравномерную изученность локусов микросателлитной ДНК у североамериканских и азиатских популяций вида. На фоне многочисленных работ [10—15 и др.], посвященных изучению полиморфизма микросателлитов у различных нативных форм форелей Северной Америки и интродуцированных форм в Европе, исследования по камчатским представителям вида долгое время не проводились. Первое изучение полиморфизма микросателлитных локусов, проведенное нами в 2002 г. [16], выявило пространственно-генетическую дифференциацию камчатской микижи. Дальнейшее исследование, проведенное совместно с американскими коллегами [17], подтвердило географическую уникальность камчатских популяций по изменчивости микросател-литных маркеров. При этом основной целью исследования было определение уровня различий между формами микижи в пределах одной реки. Между
Таблица 1. Характеристика исследованного материала
Район сбора Дата сбора Характеристика выборки Объем выборки Обозначение
р. Сопочная 2002 Проходная и жилая формы 25 SOP
р. Утхолок 2004 То же 53 UTH
р. Двухъюрточная 2004 Жилая форма 16 DVU
р. Тигиль 2002 » 16 TIG
р. Еловка 2006 » 9 ELV
р. Седанка 2002 » 33 SED
р. Коль 2004 Проходная и жилая формы 25 KOL
р. Быстрая 2005 Жилая форма 7 BST
Чили — hatchery 2006 Рыборазводная линия 13 CHH
Чили — р. Canalal 2006 Жилая форма 13 CHC
Чили — р. Gala 2006 Эстуарная форма 14 CHG
США — р. Quinault (Washington) 2004 Генетическая линия "coastal", проходная форма 15 USC
США - р. Clearwater (Idaho) 2004 Генетическая линия "inland", жилая форма 10 USI
"полуфунтовиками" и резидентной формой в р. Ут-холок (западное побережье Камчатки); резидентной и анадромной формами из р. Сопочная (западное побережье Камчатки) значимых различий обнаружено не было [17]. В вышеупомянутых исследованиях [16, 17] использовались локусы, высокополиморфные у североамериканских форелей. В то же время существует ряд микросателлитных локусов, исследуемых у близкородственных лососевых видов и зарекомендовавших себя как хорошие популяционные маркеры [18, 19]. Применение этих маркеров для камчатских популяций микижи представляется перспективным развитием использования изменчивости микросателлитной ДНК в попу-ляционно-генетическом анализе вида. Ранее из 43 локусов, применяемых в исследованиях камчатских лососевых рыб, были отобраны 10, наиболее подходящие для работ с микижей [8]. Данным исследованием предполагается их изучение у камчатских популяций Parasalmo (O.) mykiss.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалом для исследования полиморфизма микросателлитных локусов послужили выборки от различных морфоэкологических форм микижи из речных бассейнов западного и восточного побережий Камчатки, собранные в период 2002—2006 гг. Также для сравнения были взяты выборки из водоемов Чили, собранные авторами в 2006 г., и предоставленные нам морской службой США (NFMS USA) сборы от различных генетических линий Parasalmo (O.) mykiss из Северной Америки (2004 г.). Список выборок и их обозначения приведены в табл. 1; географическая локализация камчатских выборок указана на рис. 1. В ряде случаев выборки
резидентной и проходной форм были объединены в пределах одной популяции (микижа из рек Утхолок, Сопочная, Коль). Данный материал не позволяет корректно исследовать различия между разными внутрипопуляционными формами, но позволяет характеризовать каждую такую популяцию в целом. Принадлежность к той или иной форме на уровне материала приводится, так как может быть полезна для дальнейших работ.
Для анализа ДНК кусочки грудных плавников микижи фиксировали в 96%-ном этаноле. Тотальную ДНК выделяли стандартным методом, включающим гомогенизацию материала с буфером Net 25 (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-HCl, pH 7.5-8.0, 25 мМ EDTA), лизис клеток 3%-ным саркозилом Na, инкубацию лизата с протеиназой К (100 мкг/мл) в течение 3 ч при 60°С и депротеинизацию смесью фенол-хлороформ (1 : 1) и хлороформ-изоамиловый спирт (24 : 1).
Для ПЦР-амплификации использовали наборы GenePak PCR Core (ООО "Лаборатория Изоген", Россия). Инкубационная смесь 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезоксирибонук-леотида (dTTP, dCTP, dATP dGTP), 1.5 мМ MgCl2, 50 нг геномной ДНК и 100 нг специфического праймера. Амплификацию микросателлитных локусов проводили в термоциклере MJ Research PTC-100 при следующем режиме: денатурация в течение 2 мин при 94°С, затем 8 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при температуре 94°С, 30 с отжига праймеров при Х°С и синтез новых цепей в течение 30 с при 72°С; затем следовал 21 цикл, включающий 30 с при 94°С, 30 с — Х°С и 15 с при 72°С; элонгация 3 мин при 72°С. Температура отжига для индивидуальной пары праймеров дана в табл. 2.
Таблица 2. Характеристика полиморфных микросателлитных локусов
Локус Повторяющаяся последовательность Температура отжига, °С Интервал размеров аллелей, пн Источник информации о последовательности праймеров
Ssa197 (GT)nC(TG)nTC(TG)nA(GTGa)n 54 108-128 [21]
Ssa20.19 (ACTG)n 50 74-90 [22]
0ne103 (ATCT)nNn(ATCT)n 52 79-211 [23]
0ne104 (ATCT)nNn(ACTC)n 50 140-260 [23]
0ne108 (ATCT)n 50 152-264 [23]
0ne111 (TAGA)n 56 166-246 [23]
0ne112 (ATCT)n 54 111-243 [23]
0ts3 (ТС)п 50 64-92 [24]
0ki10 (CTGT)n 48 70-170 [25]
0my1011 (CAGA)n 50 140-220 База данных "Mol. Ecol"
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6%-ном неденатурирующем полиакри-ламидном геле в 0.5х ТВЕ буфере [20] при 300 В в течение 2—3 ч, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете. В качестве маркеров длины фрагментов использовали ДНК плазмиды pBr322, обработанную рестриктазами HaelII или HpalI. Размеры аллелей по каждому локусу определяли с использованием программы 1D Image Analysis Software Version 3.5 фирмы "Кодак".
Сведения об отобранных нами ранее у камчатской микижи 10 полиморфных локусов [8] приведены в табл. 2.
Оценку частот аллелей, аллельного разнообразия, ожидаемой и наблюдаемой гетерозиготности, статистические тесты на соответствие наблюдаемых по каждому локусу генотипических распределений равновесию Харди—Вайнберга (внутрипопуляци-онные коэффициенты инбридингаf [26] осуществляли с использованием программы GDA [27]. Программный пакет GENEPOP 3.4 [28] был использован для оценки неравновесия по сцеплению, степени дифференциации популяций F^, расчета генетических дистанций Нея [29] и оценки значимости попарной генетической дифференциации между выборками с использованием критерия х2. Все вероятностные тесты были основаны на методе цепей Маркова [30]. Значимость величин Fst оценивали с использованием программного пакета Arlequin 3.11 [31]. Степень дифференциации популяций оценивали также величиной 0 (аналога F^-стати-стики [26]) с использо
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.