ГЕНЕТИКА, 2010, том 46, № 7, с. 1004-1008
КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.17:597.553.2
АНАЛИЗ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ ДНК У КАМЧАТСКОЙ МИКИЖИ (Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss). ПОДБОР ЛОКУСОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДИКИ
© 2010 г. А. В. Семенова1, Г. А. Рубцова2, К. И. Афанасьев2, С. Д. Павлов1
Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, кафедра ихтиологии, Москва 119991;
e-mail: seman2000@yandex.ru 2Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова, Москва 119991;
e-mail: afanasiev@vigg.ru Поступила в редакцию 14.07.2009 г.
Исследована изменчивость выборки микижи из природных популяций нескольких рек Камчатского полуострова по 43 микросателлитным локусам ДНК, ранее используемым для анализа азиатских популяций близкородственных лососевых рыб. Десять из них могут рассматриваться как маркеры и представляются перспективными для дальнейших исследований внутривидовых отношений камчатской микижи. Их использование на больших по количеству выборках из разных локальностей и популяций Parasalmo (О.) mykiss в азиатской части ареала будет достаточно эффективным для проведения популяционно-генетического анализа камчатской группы вида.
РагазаЫо (О.) туШзз — сложный полиморфный вид, отличающийся высокими адаптивной пластичностью и фенетическим разнообразием. Популяционно-генетический анализ микижи на камчатском полуострове с использованием генетических маркеров, широко применяемых у других лососевых и североамериканских представителей вида, показал, что многообразие ее форм не поддерживается на генетическом уровне [1—3]. В частности, использование набора локусов микро-сателлитной ДНК, широко используемых в качестве маркеров для североамерканских представителей вида [4], оказалось неэффективным для дифференциации камчатской группы микижи. Большинство маркеров на других участках ДНК (аллозимы, отдельные гены ядерной и мтДНК) также не дало полной картины понимания отношений между камчатскими популяциями [5].
В связи с этим был произведен поиск новых маркеров для популяционно-генетической дифференциации микижи на камчатском ареале мик-росателлитных локусов ДНК. Микросателлиты, или короткие тандемные повторы (8ТЯ) последовательностей, состоящих из 2—6 пар нуклеотидов и варьирующих по числу повторов, широко применяются для исследования генетического полиморфизма. Высокий уровень гетерозиготности и предполагаемая селективная нейтральность микросателлитов делают их весьма удобными для анализа генетической дифференциации популяций и межпопуляционных взаимодействий [6]. Основной задачей исследования стал отбор из
числа локусов микросателлитной ДНК, высокоэффективных при исследования популяций других лососевых камчатского региона, ряда маркеров с надежно интерпретируемым полиморфизмом, пригодных для оценки популяционных отношений камчатской микижи.
Материалом для исследований послужила выборка микижи (30 экз.), представленная особями из естественных популяций микижи рек западной и восточной Камчатки. В выборку вошли по 10 экземпляров из рек Утхолок, Коль (западное побережье) и Быстрая (восточное побережье).
Для анализа ДНК кусочки грудных плавников микижи фиксировали в 96%-ном этаноле. Тотальную ДНК выделяли стандартным методом, включающим гомогенизацию материала с буфером Net 25 (100 мМ NaCl, 20 мМ трис-НС1, рН 7.5—8, 25 мМ EDTA), лизис клеток 3%-ным саркозилом Na, инкубацию лизата с протеиназой К (100 мкг/мл) в течение 3 ч при 60°С и депротеи-низацию смесью фенол—хлороформ (1 : 1) и хло-роформ—изоамиловый спирт (24 : 1).
Для ПЦР-амплификации использовали наборы GenePak PCR Core (ООО "Лаборатория Изо-ген", Россия). Инкубационная смесь 20 мкл содержала буфер для ПЦР, 200 мкМ каждого дезок-сирибонуклеотида (dTTP, dCTP, dATP, dGTP), 1.5 мМ MgC12, 50 нг геномной ДНК и 100 нг специфического праймера. Амплификацию микро-сателлитных локусов проводили в термоциклере MJ Research PTC-100 при следующем режиме: де-
АНАЛИЗ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ ДНК 1005
Таблица 1. Апробированные микросателлитные локусы у микижи
№ п.п. Локус ПЦР-продукт Размер продукта, пн Наличие полиморфизма Источник информации о последовательности праймеров
1 SsaF43 - - - [8]
2 Ssa20.19 + 74-90 Р [8]
3 Ssa28 - - - [8]
4 Ssa197 + 108-128 Р [9]
5 Ssa13.37 - - - [10]
6 Ssa404 - - - [11]
7 Ssa410 - - - [11]
8 Ssa417 - - - [11]
9 Ogo2 + 170-190 Р [12]
10 Ogo 5 + 120-150 Р [12]
11 Ogo8 + 138-220 Р [12]
12 One100 - - - [13]
13 OneWl + 97-229 Р [13]
14 Onel02 + 200-250 Р [13]
15 Üne103 + 79-211 Р [13]
16 Onel04 + 140-260 Р [13]
17 0nel05 - - - [13]
18 Üne106 - - - [13]
19 One108 + 152-264 Р [13]
20 One109 + 94 М? [13]
21 One 110 + 214 M? [13]
22 One111 + 166-246 P [13]
23 One112 + 111-243 P [13]
24 Otsl - - - [9, 14]
25 Ots2 - - - [14]
26 Ots3 + 64-92 P [15]
27 Okil + 90-130 P [16]
28 Üki2 + 150-230 P [16]
29 Oki3 + 242-290 P [16]
30 Üki7 + 210 M? [16]
31 0ki10 + 70-170 P [16]
32 Üki13 + 60-90 P [16]
33 Oki18 + 114 M? [16]
34 Üki20 - - - [16]
35 Ocll + 80-110 P База данных "Mol. Ecol."
36 Ocl2 + 160-200 P База данных "Mol. Ecol."
37 Üke3 + 249 M? [16]
38 Oke4 + 242-290 P [17]
39 Oke5 + 130-160 P [17]
40 Oke8 - - - [17]
41 Oke9 - 404-622 P [17]
42 Ükell + 90 M? [17]
43 0my1011 + 140-220 P База данных "Mol. Ecol."
Примечание. "—" — при использованной температуре отжига продукт получен не был, Р — локус полиморфный, М? — локус мономорфный, возможен незначительный полиморфизм.
1006 СЕМЕНОВА и др.
Таблица 2. Характеристика полиморфных микросателлитных локусов
№ п.п. Локус Повторяющаяся последовательность Температура отжига, °С Интервал размеров аллелей, пн
1 Ssa197 (GT)nC(TG)nTC(TG)nA(GTGa)n 54 108-128
2 Ssa20.19 (ACTG)n 50 74-90
3 0ne103 (ATCT)nNn(ATCT)n 52 79-211
4 0пе104 (ATCT)nNn(ACTC)n 50 140-260
5 0ne108 (ATCT)n 50 152-264
6 0ne111 (TAGA)n 56 166-246
7 0ne112 (ATCT)n 54 111-243
8 0ts3 (TC)n 50 64-92
9 0ki10 (CTGT)n 48 70-170
10 0my1011 (CAGA)n 50 140-220
натурация в течение 2 мин при 94°С, затем 8 циклов, включающих 1 мин денатурации ДНК-матрицы при температуре 94°С, 30 с отжига прайме-ров при Х°С и синтез новых цепей в течение 30 с при 72°С; затем следовал 21 цикл, включающий 30 с при 94°С, 30 с - Х°С и 15 с при 72°С; элонгация 3 мин при 72°С. Температура отжига для индивидуальной пары праймеров дана в табл. 2.
Продукты амплификации разделяли путем электрофореза в 6%-ном неденатурирующем по-лиакриламидном геле в 0.5 х ТВЕ-буфере [7] при 300 В в течение 2-3 ч, окрашивали бромистым этидием и фотографировали в УФ-свете. В каче-
стве маркеров длины фрагментов использовали ДНК плазмиды рВг322, обработанную рестрикта-зами НаеШ или HpalI. Размеры аллелей по каждому локусу определяли с использованием программы 1D Image Analysis Software Version 3.5 фирмы "Кодак".
В табл. 1 представлены микросателлитные ло-кусы, апробированные для изучения популяци-онно-генетической структуры микижи. Исследовано 43 микросателлитных локуса, описанных ранее для семги Salmo salar и видов лососей рода Oncorhynchus. В ряде случаев при рекомендован-
•W"
—
pBr/Hpa II pBr/Hpa II
с, 5=5 =
1 г — —
—
147 _
122
' 7 - ^тт __ __
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 151617181920
Пример полиморфного распределения 8ТК-паттернов, полученных с помощью праймера Б8а\97 у микижи р. Утхолок (образцы 1-4, 6-10) и р. Быстрой (образцы 11—14, 16—20). Дорожки 5 и 15 - маркер длины фрагментов ДНК плазмиды рВг322, обработанной рестриктазой НраИ.
АНАЛИЗ МИКРОСАТЕЛЛИТНОЙ ДНК
1007
ных авторами условиях ПЦР-продукт получен не был. Несколько локусов оказались мономорфными.
Фенотипы локуса 0ne101 у всех исследованных рыб аналогичны таковым 0ne103, отличаясь лишь по величине амплифицированных фрагментов на одно и то же значение (18 пн). Поэтому для последующего анализа будет использован лишь один из локусов — 0ne103.
Для дальнейших исследований дифференциации Parasalmo (О.) mykiss были выбраны 10 полиморфных локусов, генетическая изменчивость которых может объясняться географическими различиями популяций микижи, включенной в тестируемую выборку. Для этих локусов была проведена оптимизация условий ПЦР и электро-форетического разделения полученных ДНК-продуктов (табл. 2). Стало очевидным, что большинство из них могут рассматриваться как генетические маркеры для камчатских представителей вида, перспективные для изучения внутривидовой дифференциации микижи, поскольку уже предварительные данные выявляют визуальные различия между отдельными выборками западной и восточной Камчатки (рисунок). В частности, на приведенной электрофореграмме локуса Ssa197 очевидны различия в частотах аллелей между образцами 1-4, 6-10 (популяция р. Утхо-лок — западное побережье) и 11-14, 16-20 (популяция р. Быстрой — восточное побережье). Более детально эти отношения будут нами оценены в следующих работах на большем материале.
Таким образом, для дальнейших исследований внутривидовых отношений камчатской микижи представляется перспективным применение подобранных локусов микросателлитной ДНК. Их использование на больших по количеству выборках из разных локальностей и популяций Parasalmo (О.) mykiss в азиатской части ареала может быть достаточно эффективным для популяцион-но-генетического анализа этого вида.
Работа выполнена при частичной финансовой поддержке гранта РФФИ № 08-04-01217а.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Павлов С.Д. Аллозимная изменчивость и генетическая дивергенция тихоокеанских форелей (род Parasalmo) западной Камчатки // Генетика. 2000. Т.36. № 9. C. 1251-1261.
2. Павлов С.Д., Колесников А.А., Мельникова М.Н., Ушакова М.В. Генетическая дивергенция камчатской микижи (Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss) на ареале по результатам рестрикционного анализа и секвенирования гета цитохрома b мтДНК // Генетика. 2004. Т. 40. № 12. С. 1695-1701.
3. Мельникова М.Н., Павлов С.Д., Колесников А.А., Петров П.Б. Поиск и конструирование популяци-онно-генетических SCAR-маркеров для камчатской микижи Parasalmo (Oncorhynchus) mykiss // Генетика. 2010. T. 46. № 6. C. 792-797.
4. McPhee M.V., Utter F., Stanford J.A. et al. Population structure and partial anadromy in Oncorhynch
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.