ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2015, том 79, № 8, с. 1170-1175
УДК 538.911+577.325.3
АНАЛИЗ ОСОБЕННОСТЕЙ МЁССБАУЭРОВСКИХ СПЕКТРОВ СОЕВОГО ЛЕГГЕМОГЛОБИНА a В ОКСИ- И ДЕЗОКСИФОРМАХ ВО ВЗАИМОСВЯЗИ СО СТРУКТУРОЙ БЕЛКА
© 2015 г. А. Кумар1, 2, А. П. Захарова3, И. В. Аленькина3, М. И. Оштрах3, В. А. Семёнкин3
E-mail: oshtrakh@gmail.com
Проведен анализ мёссбауэровских спектров соевого леггемоглобина а в окси- и дезоксиформах, измеренных с высоким скоростным разрешением при 90 K, в сравнении с мёссбауэровским спектром стандартного поглотителя нитропруссида натрия, измеренного при комнатной температуре. Мёсс-бауэровские спектры соевого леггемоглобина а на основании выявленных особенностей формы линий были аппроксимированы суперпозицией двух квадрупольных дублетов для оксиформы белка и трех квадрупольных дублетов для дезоксиформы белка. Эти компоненты спектров были связаны с двумя конформационными состояниями имидазольного кольца His E7 в дистальной области гема оксиформы соевого леггемоглобина а и тремя конформационными состояниями имидазольного кольца His F8 в проксимальной области гема дезоксиформы соевого леггемоглобина а.
DOI: 10.7868/S0367676515080190
ВВЕДЕНИЕ
Мономерные растительные гемоглобины (лег-гемоглобины) связывают молекулярный кислород для защиты от его токсического воздействия комплекса фермента нитрогеназы в процессе фиксации азота [1]. Леггемоглобин содержит гем (активный центр) — комплекс Ре(П)-протопор-фирин IX, в котором четыре пиррольных атома азота (Nheme) связаны с центральным атомом железа, образуя четырехкоординационный комплекс Fe. Пятая координационная связь Fe используется для формирования ковалентной связи с белком посредством аминокислотного остатка гистидина в 8-м положении F-спирали белка (His F8) в проксимальной области гема, а шестая координационная связь Fe доступна для обратимого связывания кислорода в лигандном кармане (дистальная область гема) с противоположной стороны проксимальной области. Дистальная область гема (лигандный карман) ограничена несколькими аминокислотными остатками, такими как гистидин в 7-м положении E-спирали белка (His E7) и тирозин в 10-м положении B-спирали белка (Tyr B10). His E7 может стабилизировать связанную с Fe молекулу кислорода путем образования с ней водородной связи.
1 Department of Biochemistry, University of Delhi South Campus, New Delhi, India.
2 School of Biological Science, 320 Manter Hall, University of Nebraska, Lincoln, Nebraska, USA.
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования Уральский федеральный университет имени первого президента России Б.Н. Ельцина, Екатеринбург.
Структура соевого леггемоглобина а и областей гема в дезокси- и оксиформах показана на рис. 1. Соевый леггемоглобин а — это белок, хорошо изученный биохимическими методами (см. [2]). Однако в противоположность другому мономерному гемопротеину миоглобину леггемо-глобины еще не исследовались методом мёссбауэ-ровской спектроскопии. Ранее проведенные исследования тетрамерных гемоглобинов и миогло-бинов методом мёссбауэровской спектроскопии показали небольшие различия параметров сверхтонкой структуры ядер 57Ге [3, 4], что может быть связано с малыми различиями в стереохимии Fe(II) в геме этих белков. Также оказалось интересным, что в области температуры жидкого азота форма линий для мономерного оксимиоглобина и тетрамерного оксигемоглобина была различной [4]. Наблюдаемая асимметрия формы линий поглощения оксигемоглобина в этой области температур была связана с различными ориентация-ми молекулы кислорода в а- и Р-субъединицах тетрамерных оксигемоглобинов (см. [5—7]), поэтому после первого сравнения мёссбауэровских параметров соевого леггемоглобина а с известными данными для миоглобина в [8] мы представляем анализ формы линий мёссбауэровских спектров соевого леггемоглобина а во взаимосвязи со структурой белка.
1. МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
Соевый леггемоглобин а был приготовлен с использованием рекомбинантной генной инженерии и охарактеризован, как описано в работах
[8, 9]. Затем леггемоглобин в концентрированном растворе был дезоксигенирован и оксигенирован для получения образцов соевого леггемоглобина а в дезокси- и оксиформах соответственно. Около 9 мл раствора белка было использовано для одного образца. Эти образцы растворов были помещены в оправки из плексигласа диаметром 20 мм и высотой 10 мм и сразу заморожены жидким азотом. Стандартный поглотитель нитропруссид натрия (Na2[Fe(CN)5NO] • 2H2O) был приготовлен из кристаллов, растертых в тонкий порошок, который был наклеен на очищенную от железа алюминиевую фольгу диаметром 20 мм. Толщина стандартного поглотителя составляла 5 мг Fe/см2.
Мёссбауэровские спектры измерялись на автоматизированном прецизионном мёссбауэров-ском спектрометрическом комплексе с высоким скоростным разрешением. Этот комплекс был создан на базе спектрометра СМ-2201 с пилообразной формой опорного сигнала скорости, формируемого цифроаналоговым преобразователем с дискретизацией 212 (4096 шагов скорости), и азотного криостата с изменяемой температурой и движущимся поглотителем. Детальное описание комплекса и его характеристики приведены в работах [10—12]. Источник 57Со(КЬ) активностью 1.8 • 109 Бк (Ritverc GmbH, Санкт-Петербург) находился при комнатной температуре. Мёссбауэ-ровские спектры соевого леггемоглобина а измерялись в геометрии пропускания с движущимся в криостате поглотителем при 90 K и регистрировались в 4096 каналов. Однако для последующего анализа спектры конвертировались в 1024 канала путем последовательного сложения по четырем соседним каналам для увеличения соотношения сигнал/шум. Величина статистического набора импульсов в спектрах дезокси- и оксиформ леггемоглобина, представленных на 1024 канала, составляла ~6.0 • 106 и ~7.2 • 106 импульсов в канале, а соотношение сигнал/шум было 19 и 24 соответственно.
Мёссбауэровский спектр нитропруссида натрия измерялся при комнатной температуре в той же самой геометрии пропускания и конвертировался в 1024 канала со статистическим набором ~1.5 • 105 импульсов в канале и соотношением сигнал/шум 45. Эти мёссбауэровские спектры были аппроксимированы методом наименьших квадратов с использованием линии лоренцевой формы по программе UNIVEM-MS. Определялись такие параметры спектров, как изомерный сдвиг 8, квадрупольное расщепление AEQ, ширина линии Г, относительная площадь компонент спектра A, статистический критерий аппроксимации х2. Инструментальная (систематическая) ошибка для каждой точки спектра составляла ±0.5 канала (шкала скорости), инструментальная (систематическая) ошибка для параметров сверхтон-
Рис. 1. Структура соевого леггемоглобина а (PDB 1BIN) (а) и активного центра (гема) в дезоксиформе (б) и в оксиформе (в): Im — имидазольное кольцо, His— остаток аминокислоты гистидина, Tyr — остаток аминокислоты тирозина, Ne — эпсилон атом азота ими-дазольного кольца, O2 — молекула кислорода.
Эффект, % 0 2 4 6 8 10 12
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
11
Hi™
-2 -1 0 1 2
б
1- -а
0 в
10 12 3 Скорость, мм ■ с-
Рис. 2. Мёссбауэровские спектры стандартного поглотителя нитропруссида натрия (а), соевого леггемоглобина а в оксиформе (б) и в дезоксиформе (в), измеренные при 295 K (а) и 90 K (б, в). Показанные компоненты являются результатом наилучшей аппроксимации. На вставках показаны результаты аппроксимации спектров одним квадрупольным дублетом для пиков в области отрицательных скоростей, указывающие на небольшое отклонение от лоренце-вой формы линий мёссбауэровских спектров соевого леггемоглобина а в оксиформе (б) и в дезоксиформе (в). Дифференциальные спектры показаны под мёсс-бауэровскими спектрами.
кой структуры составляла ±1 канал, в то время как для ширины линии эта ошибка принималась ±2 канала. Если ошибка, рассчитанная в процессе аппроксимации (расчетная ошибка) для этих параметров, превышала инструментальную (систематическую) ошибку, то принималось наибольшее значение ошибки. Относительная ошибка для A не превышала 10%.
Мёссбауэровские спектры образцов соевого леггемоглобина а измерялись в скоростных диапазонах ~±2.5 мм • с-1 для оксиформы и ~±3.5 мм • с-1 для дезоксиформы. Ширина линии мёссбауэровских спектров нитропруссида натрия, измеренных для этих скоростных диапазонов в течение общего времени измерений около 5 недель, составила Г = = 0.229 ± 0.010 мм • с-1 и Г = 0.226 ± 0.014 мм • с-1 соответственно для обоих скоростных диапазонов, а форма линий спектров была лоренцевой. Значения 8 приведены относительно a-Fe при 295 K.
2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Мёссбауэровский спектр стандартного поглотителя нитропруссида натрия, измеренный при комнатной температуре, показан на рис. 2а. Этот спектр демонстрирует узкие линии поглощения лоренцевой формы с приведенным выше значением ширины. Мёссбауэровские спектры образцов соевого леггемоглобина а в окси- и дезокси-формах приведены на рис. 2б, в, соответственно. По этим спектрам видно значительное различие в величине изомерных сдвигов, которое обусловлено известным изменением спинового состояния Fe(II, S = 0) ^ Fe(II, S = 2) (низкоспиновое ^ высокоспиновое) при конформацион-ном переходе в белке в процессе обратимого присоединения кислорода, поскольку шестикоор-динированный в оксиформе комплекс иона железа в геме переходит в пятикоординированный комплекс в дезоксиформе и обратно (см. [13, 14]).
Ожидалось, что мёссбауэровские спектры соевого леггемоглобина а будут хорошо аппроксимироваться одним квадрупольным дублетом, как в случае мономерного миоглобина, и в противоположность тетрамерным гемоглобинам, спектры которых аппроксимировались двумя квадруполь-ными дублетами. Однако аппроксимация спектров одним квадрупольным дублетом показала несколько большую ширину линий по сравнению с шириной линии для стандартного поглотителя: Г = 0.283 ± 0.010 мм • с-1 для оксиформы и Г = = 0.331 ± 0.014 мм • с-1 для дезоксиформы. Дифференциальные спектры для этих аппроксимаций указывают на небольшое отклонение от лоренцевой формы пиков поглощения в мёссбауэровских спектрах соевого
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.