ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 2, с. 83-93
ОБЗОР =
УДК 591
АНАЛИЗ ПОВЕДЕНИЯ ОДИНОЧНЫХ МОЛЕКУЛ in vivo
ИЛИ.....ПОЧЕМУ МАЛЕНЬКАЯ РЫБКА ЛУЧШЕ БОЛЬШОГО ТАРАКАНА
© 2012 г. Владимир Корж12, Торстен Воланд3
Институт Молекулярной и Клеточной Биологии, Сингапур E-mail: vlad@imcb.a-star.edu.sg 2Департамент Биологических Наук и 3Департамент Химии, Национальный Университет Сингапура, Сингапур Поступила в редакцию 17.01.11 г. Окончательный вариант получен 30.03.11 г.
Ключевые слова: методы изучения одиночных молекул, флуоресцентная корреляционная спектроскопия, флуоресценция полного внутреннего отражения, резонансный перенос энергии флуоресценции, микроскопия при освещении выбранной плоскости, данио, медака, C. elegans.
Вместо предисловия
До недавнего времени исследования биологических свойств белка были ограничены анализом свойств белковых молекул в комплексах. Рассмотрим в качестве примера методы кристаллографии или электронной микроскопии используемые для исследовании поведения молекул в кристаллах и растворах или после фиксации биологического материала. Они незаменимы для изучения деталей структуры белковых молекул в статическом состоянии. Что же касается кинетических или динамических свойств молекул живой материи, то в силу фиксации молекул в определенной конформации эти свойства приносятся в жертву высокой степени разрешения достигаемой при исследовании структуры молекулы в статическом состоянии (Сердюк, 2002). И все же недавний прогресс в разработке новых методов исследования одиночных молекул (МИОМ) позволяет изучать свойства отдельных молекул с достаточно высоким разрешением в пространстве и времени. В биологии исходно МИОМ использовали для исследования клеток in vitro. Что же касается применения МИОМ in vivo то такие попытки были предприняты совсем недавно.
Но прежде чем начать обсуждение преимуществ и недостатков МИОМ, надо установить что подразумевается под условиями in vitro или in vivo. Некая путаница в эти понятия внесена как узкой специализацией биологов в разных областях исследования так и сравнительно недавней массовой миграцией в биологию специалистов небиологических профессий — химиков, физиков, математиков. Именно поэтому исследование клеток в культуре, что для биолога развития происходит in vitro, для кристаллографа происходит in vivo в широком смысле этого определения, т.е. в живом веществе, в то время как для биолога развития in vitro означает
содержание клеток в культуре. В этом контексте in vivo, в его узком понимании в биологии развития, предполагает исследование непосредственно в целостном живом организме. Поскольку в этом обзоре речь пойдет в основном о исследованиях на стыке оптики и биологии развития, эти термины будут применяться в их узком значении, а именно как это принято в биологии развития.
В данный момент полный потенциал МИОМ для исследований в живых организмах остается далеко не востребован. Одна из причин тому — междисциплинарная пропасть все еще разделяющая физиков и биологов. Ведь именно физики разрабатывают методы и инструменты для исследования одиночных молекул, но в силу специализации им, как правило, недостает понимания биологических процессов. В свою очередь биологи накопили значительный опыт в поддержании клеток в культуре и знают как правильно расположить клетки и животных под микроскопом. Однако большинство биологов не знакомы со сложными инструментами и тем более с моделями на стадии их разработки. А уж что касается эффективной эксплуатации этого оборудования или обработки результатов предполагающей отсутствие страха перед математическими формулами это, как говорится в Одессе, "две большие разницы". Но поскольку с развитием биоинформатики и внедрением коммерчески доступных специализированных микроскопов с хорошо знакомыми наклейками "Zeiss" и "Leica" междисциплинарная пропасть начала сужаться, появились реальные возможности измерять свойства и поведение биологических молекул in vivo. И также как "на всякую рыбину свой едок есть" так для разных потребностей разработаны различные МИОМ. А поскольку многие из этих методов основаны на флуоресценции, это
делает их особенно привлекательными для исследования живых организмов.
Подобно миру Птолемея, что покоился на трех китах, МИОМ покоятся на достижениях в нескольких областях исследования. Начало было положено фундаментальными исследованиями в кинетике релаксации и динамическом светорассеянии, а более позднее распространение МИОМ произошло благодаря внедрению конфокальной микроскопии и высокочувствительных светоде-текторов. Еще в 1970е годы детекция одиночной флуоресцентной молекулы в растворе показала реальную возможность этих методов (Hirschfeld, 1976). Тем же из читателей кого интересует история развития МИОМ, следует обратиться к специальным обзорам (Rigler, 1995; Elson, 2004). По мере развития МИОМ происходило осознание их возможностей и появлялись все более новые приложения этих методов. В частности, флуоресцентная корреляционная спектроскопия (ФКС), которую разрабатывали исходно для измерения кинетики химических реакций, в настоящее время успешно используется для измерения молекулярной аггре-гации, динамики фотофизических процессов, изменения конформации молекул и т.д.
Параллельно происходило изучение природных флуоресцентных белков (ФБ) открытие которых предвосхитило первые разработки в области МИОМ (Shimomura et al., 1962). В течение длительного времени ФБ не находили широкого применения пожалуй только за исключением аквори-на (aequorin), которым пользовались в качестве детектора внутриклеточного Са2+ (Shimomura et al., 1990; Webb and Miller, 2003). И только клонирование гена кодирующего зеленый флуоресцентный белок (ЗФБ) в 1994 году (Chalfie et al., 1994; Ormo et al., 1996) инициировало лавину статей с применением этого маркера и навсегда изменило методологию исследований в нейробиологии, биологии клетки, биологии развития и многих других разделах биологии. Вскоре стала ясна полезность флуоресцентных белков для МИОМ и прежде всего для ФКС (Terry et al., 1995). И поэтому клонирование новых генов ФБ (прежде всего из кораллов) и их модификация явились двигателем прогресса в этой области исследований (Campbell et al., 2002; Labas et al., 2002; Shaner et al., 2004). Здесь уместно отметить, что в этом процессе важную роль сыграло сотрудничество ученых Института биоорганической химии и Московского Университета, которые и в настоящее время продолжают диктовать моду в разработке новых типов ФБ и их применения (Shcherbo et al., 2007, 2010).
Принято считать, что даже генетически идентичные клетки в культуре тем не менее существенно отличаются между собой. В этой связи кажется очевидным то обстоятельство, что биологическая активность клеток различных органов и тканей
многоклеточного организма существенно отличается и меняется в зависимости от окружающей среды. Однако остается неясным отличаются ли основные свойства биологических макромолекул in vitro и in vivo в той же степени, что и биологическая активность клеток в культуре и в живом организме. Такое сравнительное исследование можно провести используя МИОМ основанные на флуоресценции для анализа биологических процессов в клетках в культуре или в прозрачных животных, таких как например круглые черви C. elegans или прозрачные эмбрионы модельных позвоночных — данио (Danio rerio) и медаки (Oryzeas latipes). Как и ожидалось, первые исследования такого рода в основном имели целью доказать их практическую возможность in vivo и потому лишь приоткрыли завесу скрывающую сложность биологических процессов на уровне отдельных молекул в клетках многоклеточных животных.
Применение МИОМ для анализа процессе развития in vivo
Введение в флуоресцентную корреляционную спектроскопию (ФКС)
Будучи разработан почти 40 лет тому назад (Magde et al., 1972) ФКС представляет собой очень чувствительный метод основанный на статистическом анализе колебаний флуоресценции измеряемых в ограниченном наблюдаемом объеме (рис. 1). Такие колебания содержат информацию о динамическом поведении флуоресцирующих молекул. Любой молекулярный процесс изменяющий флуоресценцию в наблюдаемом объеме может быть зарегистрирован и анализирован посредством коррелляционной функции. Нормализованная автокорреляционная функция (АКФ) определяется как:
G(T) = < F( t) F( t + t ))
<F(t))2
где <...) определяет среднее время и and F(t) представляет собой интенсивность флуоресценции за время t. По выполнении автокорреляционного анализа экспериментальные кривые АКФ сравнивают с соответствующей моделью исследуемого процесса. Таким образом можно регистрировать и оценивать любое влияние на коэффициент диффузии за счет изменений среды окружающей флуоресцирующую частицу или ее взаимодействие с компонентами среды.
Измерение изменения флуоресценции позволяет описать динамическое поведение флуоресцирующих молекул и таким образом измерить их концентрацию и коэффициент диффузии. Эти параметры содержат достаточно информации для
вычисления констант диссоциации и стехиометрии связывания (Rauer et al., 1996; Van Craenenbro-eck and Engelborghs, 1999; Wohland et al., 1999), агг-регации и периода временного связывания (Starchev et al., 1998; Eggeling et al., 2009), взаимодействия белков с компонентами мембраны и в частности с ее липидами (Перевощикова, 2009; Перевощикова и др., 2009; Pramanik and Rigler, 2001; Kahya et al., 2004; Bacia et al., 2004; Briddon and Hill, 2007) и т.д.
Введение в флуоресценцию полного внутреннего отражения (ФПВО)
В микроскопах основанных на принципе полного внутреннего отражения (ПВО) свет покидает объектив микроскопа в виде параллельного пучка световых лучей (рис. 2). Когда луч достигает предметное стекло, а с ним и границу раздела стекла и воды весь луч может быть отражен при условии, если угол падения превышает критический угол qc, который зависит от коэффициентов рефракции воды и стекла (sin qc = иводы/истекла). При этом на границе воды и стекла освещается тонкий слой среды прилежащий к стеклу. ФПВО применяется для освещения и возбуждения флуоресцентных веществ находящихся на или вблизи границы раздела стек
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.