УДК 571.27
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ПРОФИЛАКТИКИ ОСТРОЙ РЕАКЦИИ ТРАНСПЛАНТАТ ПРОТИВ ХОЗЯИНА С ПОМОЩЬЮ МУЛЬТИПОТЕНТНЫХ МЕЗЕНХИМНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ДОНОРА У БОЛЬНЫХ ГЕМОБЛАСТОЗАМИ ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КОСТНОГО МОЗГА
© 2014 И.Н. Шипунова1, Н.А. Петинати1, А.Е. Бигильдеев1, Е.А. Зезина1,2, Н.И. Дризе1*, Л.А. Кузьмина1, Е.Н. Паровичникова1, В.Г. Савченко1
1 Гематологический научный центр Минздрава России, 125167Москва, Новый Зыковский прд., д. 4; факс: +7(495)614-0636,
электронная почта: ndrize@yandex.ru 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва
Поступила в редакцию 03.07.14
Аллогенная трансплантация костного мозга (алло-ТКМ) в настоящее время является единственным методом излечения многих заболеваний крови. Однако ее применение ограничено тяжелыми осложнениями, основным среди которых является реакция трансплантат против хозяина (РТПХ). В связи с недостаточной эффективностью существующих методов профилактики РТПХ, активно исследуются новые, в том числе применение мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК) донора. В работе анализировали результаты профилактики острой РТПХ (оРТПХ) с помощью ММСК у больных гемобластозами после алло-ТКМ. В исследование было включено 77 пациентов. Они были рандомизированы на две группы: получавшие стандартную профилактику оРТПХ и те, кому дополнительно вводили ММСК донора костного мозга. Показано, что введение ММСК снижает частоту развития оРТПХ в два раза и увеличивает выживаемость пациентов. 4 из 39 образцов ММСК оказались неэффективными для профилактики оРТПХ. Анализ отдельных характеристик доноров (пол, возраст, индекс массы тела), свойств ММСК этих доноров (параметры роста, уровень экспрессии 30 генов, участвующих в пролиферации, дифференцировке, иммуномоду-ляции) не выявил значимых отличий между ММСК, эффективными и неэффективными для профилактики оРТПХ. Метод множественной логистической регрессии позволил установить сочетание признаков, характеризующих образцы ММСК, наиболее подходящие для профилактики оРТПХ. Построена модель, которая позволяет заранее оценить успешность применения анализируемых образцов ММСК. Значимыми для модели признаками оказались повышенный относительный уровень экспрессии гена ЕОЕШ в сочетании со сниженными уровнями экспрессии генов РРЛЯО и ЮП. В зависимости от выбранного значения вероятности успешного применения ММСК данная модель позволяет правильно предсказать результат использования ММСК в 82—94% случаев. Предложенная модель проспективной оценки эффективности использования ММСК даст возможность предотвратить развитие оРТПХ у максимального количества пациентов.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: мультипотентные мезенхимные стромальные клетки (ММСК), аллогенная трансплантация костного мозга (алло-ТКМ), острая реакция трансплантат против хозяина (оРТПХ), относительный уровень экспрессии генов, множественная логистическая регрессия.
Трансплантация аллогенного костного мозга (алло-ТКМ) является единственным методом излечения многих заболеваний крови, в том числе лейкемии [1]. Применение этого метода ограничено связанными с ним тяжелыми осложнениями [2]. Одним из основных осложне-
* Адресат для корреспонденции.
ний алло-ТКМ является острая реакция трансплантат против хозяина (оРТПХ) [3]. РТПХ является ответом иммунной системы донора на отличающиеся антигены реципиента [4]. При использовании современных методов профилактики РТПХ у 30—40% пациентов после трансплантации от НЬА-идентичного донора развивается оРТПХ [5, 6]. Подбор донора для транс-
1664
плантации осуществляется на основании совпадения шести основных антигенов главного комплекса гистосовместимости. Ужесточение критериев приводит к снижению вероятности подбора донора, поэтому актуальной проблемой для врачей, занимающихся алло-ТКМ, является поиск более эффективных методов профилактики РТПХ.
Процессы, приводящие к развитию оРТПХ, начинаются еще до трансплантации. Для уменьшения остаточной опухолевой массы, подавления иммунной системы реципиента и предотвращения отторжения трансплантата перед трансплантацией проводится химиотерапия, которая повреждает ткани пациента [7]. Происходит активация моноцитов и макрофагов поврежденных тканей и они секретируют провоспалитель-ные цитокины, такие как интерлейкин-1р и ин-терлейкин-6 [8—10]. Эти цитокины активируют Т-клетки донора, которые в свою очередь секре-тируют интерлейкин-2 и интерферон у [9]. Выброс цитокинов стимулирует образование молекул адгезии и увеличивает число молекул главного комплекса гистосовместимости на клетках большинства тканей реципиента [6, 11, 12], создавая благоприятные условия для развития оРТПХ.
Однако не все процессы, происходящие в организме после алло-ТКМ, приводят к развитию оРТПХ, некоторые направлены на ее подавление [13, 14].
В последнее время появляется все больше работ, посвященных возможностям лечения и профилактики оРТПХ с помощью мультипо-тентных мезенхимных стромальных клеток (ММСК). Эти клетки стромы костного мозга можно культивировать in vivo. Особенностью ММСК является способность прилипать к пластику и дифференцироваться под воздействием соответствующих стимулов [15]. ММСК секре-тируют различные цитокины, ростовые факторы и молекулы внеклеточного матрикса [16, 17]. Эти клетки обладают уникальными иммуномо-дулирующими свойствами [18]. Кроме того ММСК не вызывают иммунного ответа, то есть для применения в клинике можно использовать клетки, полученные от любого донора, без проверки тканевой совместимости [19, 20]. Результаты исследований in vivo показали, что ММСК могут быть использованы для предотвращения развития и лечения оРТПХ. На основании полученных данных ММСК начали применять в клинике для лечения оРТПХ [21—23]. Однако механизм их иммуномодулирующего действия остается неизвестным, а работы на животных моделях пока не дали однозначных результатов. В различных исследованиях было установлено,
что ММСК высокоэффективно предотвращают развитие оРТПХ [24, 25].
Свойства ММСК могут позволить решить основную проблему ТКМ — поиск эффективного метода профилактики оРТПХ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Пациенты. Проспективное рандомизированное исследование было начато в октябре 2008 г. Исследование было одобрено этическим комитетом ГНЦ Минздрава России. Все пациенты и доноры костного мозга подписали информированное согласие на участие в исследовании.
В исследование было включено 77 пациентов, 37 женщин и 40 мужчин, в возрасте от 17 до 63 лет (медиана 34 года), которым была выполнена аллогенная трансплантация костного мозга от ИЬА-идентичных сиблингов в отделении Высокодозной химиотерапии гемобластозов, депрессий кроветворения и трансплантации костного мозга ГНЦ Минздрава России в период с октября 2008 по апрель 2014 г. Всем больным трансплантацию аллогенного костного мозга выполняли как этап лечения гемобласто-зов. Миелоаблативное кондиционирование проводили 43 пациентам, оно включало бусульфан и циклофосфан. Немиелоаблативное кондиционирование 34 пациентам в ремиссии проводили флюдарабином, бусульфаном и антитимоцитар-ным глобулином.
Пациенты были рандомизированы на две группы, равнозначные по полу и возрасту. Рандомизацию производили в день алло-ТКМ блочным методом. Больным в первой группе проводили стандартную профилактику оРТПХ, а во второй группе помимо стандартной профилактики оРТПХ вводили ММСК, выделенные из донорского костного мозга, полученного для алло-ТКМ. ММСК вводили внутривенно струй-но в момент восстановления показателей лейкоцитов в периферической крови до 1 х 109/л. Средняя доза введенных ММСК составляла 1,2 (0,9—1,65) х 106кл/кг массы тела пациента. В ходе стандартной профилактики оРТПХ пациенты получали циклоспорин и метотрексат, некоторые пациенты дополнительно получали мо-фетт микофенолат или преднизолон.
Степень оРТПХ определяли согласно международным принятым критериям [26].
Доноры. Группа доноров состояла из 77 человек (35 женщин и 42 мужчины), в возрасте от 13 до 59 лет (медиана 34 года).
ММСК. ММСК выделяли из 25-30 мл костного мозга доноров гемопоэтических клеток. Для выделения мононуклеаров костный мозг
смешивали с равным объемом среды аМЕМ («ICN»), содержащей 0,2%-ную метилцеллюлозу (1500 cP, «Sigma-Aldrich», США). Через 40 мин большинство эритроцитов и гранулоцитов оседали, в то время как мононуклеарные клетки оставались в суспензии. Затем верхнюю фракцию (суспензию) отбирали и центрифугировали в течение 10 мин при 450 g. Клеточный осадок ресуспендировали в стандартной среде для культивирования, состоящей из среды aMEM с 4%-ной плазмой, обогащенной тромбоцитами, полученной от доноров гемопоэти-ческих клеток [27], 2 мМ L-глутамина («ICN»), 100 ед/мл пенициллина («Ferein», Россия ) и 50 мкг/мл стрептомицина («Ferein») и 2 ед/мл гепарина («Sigma», США). Клетки культивировали по 27 х 106 клеток на флакон T175 см2 («Corning-Costar», США). После формирования конфлюэнтного монослоя клетки отмывались 0,02%-ным ЭДТА («MP Biomedicals», США) в физиологическом растворе («Sigma-Aldrich»), а затем обрабатывали трипсином («MP Biomedicals»). Клетки рассаживали по 4 х х 103 кл/см2 площади флакона. Культуры держали в условиях гипоксии при 37° в атмосфере с 5%-ной CO2 и 5%-ным O2. ММСК собирали в раствор 6%-ного полиглюкина и криоконсерви-ровали с 10%-ным диметилсульфоксидом («ROTH»), при необходимости разводили до конечной концентрации 3—7 х 106 кл/мл полиглю-кина и вводили пациентам внутривенно. Крио-консервирование не влияло на иммуномодули-рующие свойства ММСК, что было показано в диссертационной работе Н.А. Петинати (автореферат диссертации Н.А. Петинати «Профилактика реакции трансплантат против хозяина у больных гемобластозами после аллогенной трансплантации костного мозга с помощью мультипотентных мезенхимных стромальных клеток донора», Москва, 2013 г.).
Критерии оценки ММСК для возможности клинического применения включали веретено-видную морфологическую форму, отсутствие видимых сгустков или контаминации патогенами, стандартное иммунофенотипирование [28] для определения поверхностных молекул [29] и данные по дифференцировке клеток in v
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.