ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 1, с. 28-41
БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 591
АНОМАЛИИ В РАЗВИТИИ ФЛОРАЛЬНОЙ МЕРИСТЕМЫ У ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ ТОМАТА НЕ ЗАВИСЯТ ОТ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ ЗАЩИТНЫЕ PR-БЕЛКИ
И АНТИМИКРОБНЫЕ ПЕПТИДЫ
© 2014 г. М. Р. Халилуев*, **, И. А. Чабан*, Н. В. Кононенко*, Е. Н. Баранова*, С. В. Долгов*, ***, П. Н. Харченко*, В. Ю. Поляков*
*Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН
127550 Москва, Тимирязевская ул., 42 **Российский государственный аграрный университет — МСХА им. К.А. Тимирязева 127550Москва, Тимирязевская ул., 49 *** Филиал института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН
142290Московская область, Пущино, просп. Науки, 6 E-mail: marat131084@rambler.ru Поступила в редакцию 11.02.13 г.
Окончательный вариант получен 17.06.13 г.
В работе проведен морфологический и цитоэмбриологический анализ растений томата, трансформированных генами, кодирующими хитинсвязывающие белки из Amaranthus caudatus L. (ac) и A. ret-roflexus L. (RS-intron-Shir), а также гевеиноподобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. (amp2). Полученные трансгенные линии были адаптированы к почвенным условиям и выращены в защищенном грунте. Анализ трансгенных растений поколения Т0 выявил линии, фенотипически не отличающиеся от растений дикого типа, и три линии (по одной линии с каждым из вышеперечисленных генов), которые имели существенные нарушения в дифференцировке цветоносных побегов, строении цветков и плодов. Продемонстрировано сохранение нарушений в развитии генеративных органов в 6 вегетативных поколениях. Показано, что у трансгенных растений с вегетативно наследуемыми аномалиями наблюдаются нарушения в формировании мужского гаметофита, отсутствие нормального оплодотворения и, как следствие, развитие партенокарпических плодов. Детальный анализ растущих семяпочек аномальных трансгенных линий показал, что на месте неоплодотворенного зародышевого мешка формируется и разрастается замещающая ткань, по структуре отличающаяся как от зародышевой, так и от эндоспермальной ткани нормальной семяпочки. Формирование замещающей ткани происходит в результате продолжающейся пролиферации клеток эндотелия, утративших способность к нормальной дифференцировке. Конечным этапом развития замещающей ткани является ее гибель, сопровождающаяся лизисом клеток. Методом ОТ-ПЦР экспрессия целевых генов была подтверждена у всех трех линий с аномальным фенотипом, а также у ряда линий, фенотипически не отличающихся от нетрансформированного контроля. Это означает, что нарушения органов генеративной сферы у трансформированных растений не зависят от экспрессии привнесенных в геном томата гетерологич-ных генов. Обсуждается, что причиной возникновения нарушений у трансгенных растений является прямое или опосредованное влияние агробактериальной трансформации на изменение экспрессии генов, кодирующих транскрипционные факторы и контролирующих включение каскада генов, необходимых для нормального развития растений.
Ключевые слова: Solanum lycopersicum, трансгенные растения, хитинсвязывающие белки, гевеиноподобные антимикробные пептиды, нарушение идентичности флоральной меристемы, замещающая ткань зародышевого мешка.
DOI: 10.7868/S0475145014010042
В настоящее время известно, что в популяции трасгенных растений, полученных методом агробактериальной трансформации, достаточно часто встречаются растения с необычным (аномаль-
ным) фенотипом, существенно отличающимся от фенотипа дикого типа (Wilson et al., 2006). При этом диапазон наблюдаемой изменчивости крайне широк: изменение высоты растений (Feld-
mann, 1991), размеров и формы листовых пластинок (Lin et al., 2008), структуры цветка (Ohshima et al., 1997). Существенные нарушения могут возникать в генеративной сфере, которые приводят к снижению фертильности (Bavrina et al., 2007) и нарушению развития зародыша на ранних этапах эмбриогенеза (Castle, Meinke, 1994).
В современной литературе обсуждаются две основные причины этого явления. Во-первых, сомаклональная изменчивость, которая может возникать в процессе культивирования in vitro (Kaeppler et al., 2000; Jain, 2001). Показано, что высокая степень разнообразия сомаклонов зависит от исходного генотипа, типа и возраста экс-планта (Veilleux, Johnson, 1998; Jain, 2001). Кроме того, сомаклональная изменчивость у трансгенных растений может возникать по причине генетической гетерогенности соматических клеток экспланта и регенерации побегов через стадию формирования каллусной ткани, а также индуцироваться факторами среды (Evans et al., 1984; Kaeppler et al., 2000; Jain, 2001). Возникновение сомаклонов при проведении агробактериальной трансформации может быть обусловлено воздействием на растительную ткань различных стрессовых факторов. Среди них можно отметить поранение экспланта, непосредственный контакт с патогенным микроорганизмом, а также длительное культивирование каллусной ткани на питательных средах с добавлением фитогормонов и высоких концентраций селективных агентов для органогенеза трансгенных побегов. Все перечисленные стрессовые факторы сопровождаются явлениями, которые характерны для первичного неспецифического стрессового ответа, выражающиеся в образовании активных форм кислорода (окислительном "взрыве"), активации окислительных ферментов и других реакциях (Cassells, Curry, 2001; Enikeev et al., 2008).
Другой причиной возникновения растений с аномальным фенотипом может служить инсер-ция Т-ДНК (Koncz et al., 1992; Wilson et al., 2006; Deineko et al., 2007) и/или последовательностей селективных генов, бактериальных плазмид, фрагментов бактериального генома и дополнительных полных либо частичных копий вставки трансгена (Tinland, 1996; Tzfira et al., 2004).
Несмотря на то, что в ряде случаев достаточно сложно установить непосредственные причины появления растений с аномальным фенотипом, трансформационно-индуцируемые мутации широко используются для идентификации и клонирования генов, что является важным направлением по анализу структурно-функциональной орга-
низации генома растений (Ampomah-Dwamena et al., 2002).
В теоретическом плане большой интерес представляют трансгенные растения, у которых выявляются кардинальные нарушения морфогенеза генеративных органов (Avivi et al., 2000; Ampomah-Dwamena et al., 2002; Wang, Campbell, 2008). Перечисленные работы направлены на изучение и установление сигнальных путей, возникающих в ходе эмбриогенеза и необходимых для нормального развития растений. В то же время, в цитированных работах практически не затрагиваются структурные аспекты, связанные с аномалиями в формировании и развитии зародыша и окружающих его тканей, а также пыльцы.
В настоящей работе проведен детальный морфологический и цитоэмбриологический анализ трансгенных растений томата, экспрессирую-щих гены, кодирующие хитинсвязывающие белки из Amaranthus caudatus L. (ac) и A. retroflexus L. (RS-intron-Shir), а также гевеиноподобные антимикробные пептиды из Stellaria media L. (amp2), с выраженными нарушениями развития генеративных органов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Агробактериальная трансформация
Для генетической трансформации использовали бинарные векторы, в состав Т-ДНК которых в качестве целевого гена входили гены ас (pBI121ac) и RS-intron-Shir (pR830), кодирующие хитинсвязывающий белок из Amaranthus caudatus L. и A. retroflexus L. соответственно, а также ген amp2 (pBAMP2), кодирующий два гевеиноподобных антимикробных пептида (SmAMP1 и SmAMP2) из Stellaria media L. (Халилуев и др., 2010). Т-ДНК бинарных векторов содержала также ген nptII, обуславливающий устойчивость к антибиотику канамицину, для отбора трансгенной каллусной ткани и регенерантов.
Агробактериальную трансформацию проводили методом кокультивации эксплантов семядолей, полученных от двенадцати дневных проростков томата селекционной линии ЯЛФ, с разбавленной суспензией агробактерии (оптическая плотность, равная 0.4—0.6).
Индукцию процессов каллусо- и органогенеза побегов томата осуществляли при культивировании эксплантов на питательной среде MS (Mu-rashige, Skoog, 1962), дополненной 5 мг/л 6-бен-зиламинопурина (Sigma, США) и 0.01 мг/л индо-лилуксусной кислоты (Sigma, США). Для отбора каллусной ткани, устойчивой к канамицину, была использована стратегия постепенной адаптации
эксплантов семядолей к селективному агенту, исключающая их шок и массовую гибель (первый пассаж без канамицина, второй — 10 мг/л, третий и последующие — 25 мг/л). Продолжительность каждого пассажа составляла 15 дней. Элиминацию агробактерии осуществляли за счет добавления в состав питательной среды антибиотика ти-ментина (СмитКляйн Бичем Фармасьютикалз, Великобритания) в концентрации 150 мг/л. Регенерирующие канамицин-устойчивые побеги отделяли от каллусной ткани и укореняли на среде MS, содержащей половинную концентрацию макро- и микросолей, 0.2 мг/л индолилмасляной кислоты (Sigma, США) и канамицин в концентрации 100 мг/л. Укорененные регенеранты были адаптированы к почвенным условиям и выращены в защищенном грунте при температуре 22—25°C днем и 18—19°C ночью, влажности 60—70% и освещенности 2500 люкс. Размножение трансгенных линий томата, а также получение вегетативных поколений осуществляли при помощи черенкования формирующихся на взрослых растениях боковых побегов с последующим их укоренением.
ОТ-ПЦР
Выделение суммарной клеточной РНК из листьев трансгенных растений томата осуществляли с помощью набора реагентов RNA-ExtraSorb (лаборатория молекулярной диагностики и генно-инженерных конструкций ВНИИСБ) в соответствии с протоколом изготовителя. Синтез кДНК проводили в стандартных условиях (Maniatis et al., 1984) с использованием шестичленных случайных праймеров (Синтол, Россия). В качестве контроля для подтверждения сохранности РНК и синтезированной на ее основе кДНК проводили амплификацию на последовательность гена актина томата Tom 52 (NCBI, U60482). Реакцию осуществляли на амплификаторе MJ Mini™ Personal Thermal Cycler (BioRad, США) с использованием специфичных праймеров (Khaliluev et al., 2011).
Цитоэмбриологи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.