МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2007, том 41, № 1, с. 79-85
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616.006
АНОМАЛЬНОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ ГЕНОВ р16, HIC1, N33 И GSTP1 В ЭПИТЕЛИИ И СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2007 г. Т. В. Кекеева1' 2, О. П. Попова2, П. В. Шегай3, Б. Я. Алексеев3, Ю. Ю. Андреева3,
Д. В. Залетаев1' 2*, М. В. Немцова1' 2
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 2Научно-исследовательский институт молекулярной медицины при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, Москва, 119992 3Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, 125284
Поступила в редакцию 27.06.2006 г.
Принята к печати 24.07.2006 г.
Изучено метилирование генов p16, H1C1, N33 и GSTP1, вовлеченных в канцерогенез предстательной железы, в образцах ткани предстательной железы с опухолевыми новообразованиями. В результате мик-родиссекции ткани предстательной железы на гистологическом срезе выделены малигнизированные ацинусы, участки простатической интраэпителиальной неоплазии, гиперплазии, а также соединительнотканной стромы вокруг каждого типа железистых структур. Обнаружен высокий уровень метилирования генов как в малигнизированном эпителии, так и в близлежащей соединительнотканной строме. Эпигенетические изменения в строме свидетельствуют о важной роли микроокружения опухоли в процессах ее развития и прогрессии. Изучено также метилирование генов p16, H1C1, N33 и GSTP1 в операционном материале и в биопсийных образцах предстательной железы, не подвергнутых микродиссек-ции. Частоты метилирования всех генов значительно ниже в образцах ткани предстательной железы, полученных от больных аденокарциномой, чем в аналогичных микродиссекционных образцах (H1C1, 71 versus 89%; p16, 22 versus 78%; GSTP1, 32 versus 100%; N33, 20 versus 33%). Сделан вывод о необходимости микродиссекционного исследования при молекулярном анализе опухолей этого типа.
Ключевые слова: рак предстательной железы, метилирование, микродиссекция, микроокружение опухоли.
ABBERANT METHYLATION OFр16, HIC1, N33 AND GSTP1 GENES IN TUMOR EPITELIUM AND TUMOR-ASSOCIATED STROMAL CELLS OF PROSTATE CANCER, by T. V. Kekeeva12, O. P. Popova2, P. V. Shegai3, B. Ya. Alekseev3, Yu. Yu. Andreeva3, D. V. Zaletaev1,2, M. V. Nemtsova1, 2 ^Research Centre for Medical Genetic, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow, 115478 Russia; *e-mail: zalnem@online.ru; 2Institute of Molecular Medicine, Sechenov Medical Academy, Ministry of Health and Social Development of Russian Federation, Moscow, 119992 Russia; 3Moscow Herzen Oncological Research Institute, Moscow, 125284 Russia). The methylation status of four genes significant in prostate carcinogenesis p16, HIC1, N33 and GSTP1, were evaluated using quantitative methylationsensitive polymerase chain reaction. Tumor epithelia, tumor-associated stroma, normal epithelia, foci of PIN and benign prostate hyperplasia, and stroma adjacent to tumor tissues were isolated from whole-mount prostatectomy specimens of patients with localized prostate cancer by using laser capture microdissection. We found high levels of gene methylation in the tumor epithelium and tumor-associated stromal cells and some methylation in both hyperplastic epithelium and stromal cells in normal-appearing tissues located adjacent to tumors. Promoter methylation in the non-neoplastic cells of the prostate tumor microenvironment may play an important role in cancer development and progression. We examined the promoter methylation status ofp16, HIC1, N33 and GSTP1 in prostate biopsy fragments and prostate tissues after radical prostatectomy from patients with adenocarcinoma without laser capture microdissection. Methylation frequencies of all genes in tumor samples were considerably lower than frequencies in microdissected tumour samples (HIC1, 71 versus 89%; p16, 22 versus 78%; GSTP1, 32 versus 100%; N33, 20 versus 33%). The laser capture microdissection is required procedure in methylation studies taking into account multifocality and heterogenity of prostate cancer tissue.
Key words: prostate cancer, methylation, microdissection, tumor microenvironment.
Принятые сокращения: ПЖ - предстательная железа; РПЖ - рак предстательной железы; ПИН - простатическая интра-эпителиальная неоплазия; ДГПЖ - доброкачественная гиперплазия предстательной железы.
*Эл. почта: zalnem@online.ru
Рак предстательной железы (РПЖ) во многих странах является одним из наиболее часто встречающихся злокачественных новообразований у мужчин [1]. Смертность мужчин от РПЖ занимает третье место после рака легкого и толстой кишки. При этом, как следует из результатов аутопсий, значительное число патологических изменений ПЖ остаются клинически недиагнос-тированными. В США клинически неопределяемые очаги злокачественного перерождения ПЖ выявляются у 15-30% мужчин старше 50 лет и у 80% мужчин старше 80 лет [2].
Молекулярные механизмы развития и прогрессии РПЖ изучены недостаточно. Какие именно генетические изменения, возникающие в неопластических клетках, приводят в конечном итоге к злокачественной трансформации эпителия, не установлено. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста в результате метилирования Срб-островков промоторных областей генов широко распространена в опухолях различного типа, в том числе и при РПЖ [3-7]. Описано более 30 генов, которые подвергаются аномальному гиперметилированию при РПЖ [8]. Эти гены кодируют как классические и потенциальные супрессоры опухолевого роста, так и белки, принимающие участие в сигнальных путях гормонального ответа, в опухолевой инвазии, контроле клеточного цикла и репарации повреждений ДНК. Гиперметилирование генов, вовлеченных в канцерогенез, происходит на ранних стадиях опухолеобразова-ния и может служить молекулярным маркером при проведении ранней диагностики [9, 10].
К настоящему времени хорошо известна важность взаимодействия между стромальными и эпителиальными клетками не только в эмбриональном развитии, но и в канцерогенезе. Существенную роль в процессах развития и прогрессии опухолей играет также микроокружение опухоли. Оно включает в себя модифицированный внеклеточный матрикс, опухолевый неоангиогенез и характеризуется измененной экспрессией генов факторов роста [11]. Структурные нарушения генома и изменение экспрессии генов в стромальных клетках, окружающих опухоль, изучают достаточно давно [11—13]. Однако сведения об эпигенетических нарушениях в строме, ассоциированной с опухолевым эпителием, появились совсем недавно и требуют более детального изучения [14, 15].
Высокая гетерогенность и мультифокальная природа РПЖ наряду с небольшим размером ПЖ представляют серьезную проблему для исследователей. В настоящее время трудности в получении гомогенного материала опухоли в количестве, достаточном для молекулярного анализа, разрешаются с помощью лазерной микродиссекции ткани [1, 14, 16]. В представленной работе изучено метилирование Срв-островков промоторных
областей гена метаболизма ксенобиотиков GSTP, опухолевого гена-супрессора p16 и потенциальных генов-супрессоров HIC1 и N33 в опухолевом эпителии и его стромальном микроокружении. Сравнили частоты метилирования этих генов в железистых опухолевых структурах, полученных в результате микродиссекции, с частотами в операционном материале и в биопсийных образцах ПЖ без выполнения данной процедуры.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Образцы ткани ПЖ получены от 33 мужчин с диагнозом РПЖ, подвергнутых радикальной про-статэктомии, в отделении онкоурологии Московского научно-исследовательского онкологического центра им. П.А. Герцена. Также 102 образца ткани ПЖ получены при выполнении мультифо-кальной биопсии от больных с подозрением на РПЖ. У 53 из них диагноз аденокарциномы подтвержден гистологически, у 29 найдена простатическая интраэпителиальная неоплазия (ПИН), 24 больным поставлен диагноз доброкачественной гиперплазии ПЖ (ДГПЖ). Гистологическое исследование ткани выполнено в патологоанатоми-ческом отделении того же института. Средний возраст больных составил 63 г. Средний балл по шкале Глиссона составил 6 (от 4 до 8). Образцы ткани замораживали при -70°С, а также фиксировали в формалине с последующей парафинизацией.
Лазерную микродиссекцию выполняли на 5 мкм срезах, фиксированных формалином и окрашенных гематоксилином-эозином, с помощью Leica ASLMD (Германия). Материал железистых структур (аденокарциномы, ПИН, гиперплазии), а также близлежащей стромы собирали в отдельные пробирки (рис. 1). ДНК выделяли согласно [16].
Геномную ДНК из ткани экстрагировали смесью фенол-хлороформ [17]. Метилирование CpG-островков промоторных областей генов определяли при помощи метилчувствительной по-лимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувстви-тельных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали гидролизованную метилчувствитель-ными рестриктазами HpaII (CCGG) ДНК. Геномую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед.акт. рестриктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150 нг гидролизо-ванной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех HpaII-сай-тов. В случае модификации цитозина до метилци-тозина ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метили-
Гиперплазия предстательной железы. а - Увеличение 4 х 10; б - увеличение 10 х 10. Стрелкой указаны области мик-родиссекции: гиперплазированный ацинус (ж) и смежная строма (стр). Обработка срезов для лазерной микродиссек-ции, окраска гематоксилин-эозином.
рования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется. С целью исключения ложнопо-ложительных и ложноотрицательных результатов проводили
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.