МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2003, том 37, № 4, с. 696-703
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616.006
АНОМАЛЬНОЕ МЕТИЛИРОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ГЕНОВ-СУПРЕССОРОВ ПРИ СПОРАДИЧЕСКОМ РАКЕ
МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
© 2003 г. В. В. Землякова1*, А. И. Жевлова1, В. В. Стрельников3, Л. Н. Лшбченко2, Я. В. Вишневская2, В. А. Третьякова1, Д. В. Залетаев1, 3, М. В. Немцова1
1Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, Москва, 115478 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина Российской академии медицинских наук,
Москва, 115478
3Научно-исследователъский институт молекулярной медицины при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, 119992
Поступила в редакцию 10.01.2003 г.
С использованием мультилокусной метилчувствительной ПЦР определен профиль метилирования CpG-островков, расположенных в промоторных областях генов RB1, p16/CDKN2A, p15/CDKN2B, p14/ARF, CDH1, MGMT, HIC1 и N33, в 105 образцах рака молочной железы. Выявлен высокий уровень метилирования основных генов-супрессоров, участвующих в регуляции клеточного цикла по сигнальному пути Cdk-Rb-E2F, RB1 - 17% (18/105) и p16 - 56% (59/105), в 13 случаях метилированы оба гена. CpG-островок гена p15 метилирован лишь в двух случаях (2%). Метилирование CpG-ост-ровка гена p14 не обнаружено. В 37% случаев (39/105) установлено метилирование промоторной области гена CDH1. Максимальный уровень метилирования выявлен в промоторной области гена HIC1 - 83 случая из 105 (79%). Уровень метилирования CpG-островков в генах MGMT и N33 не превышал 8% (8/105) и 9% (9/105) соответственно.
Ключевые слова: рак молочной железы, гены RB1, p16/CDKN2A, p15/CDKN2B, p14/ARF, CDH1, MGMT, HIC1 и N33, промоторный район, метилирование, CpG-островок, метилчувствительная ПЦР.
Молекулярные повреждения ряда генов имеют большое значение для опухолеобразования. Изучение механизмов канцерогенеза указывает на важную роль инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, обусловленной как структурными (генетическими), так и функциональными (эпигенетическими) изменениями [1]. Один из механизмов эпигенетической регуляции - метилирование промоторных и регуляторных областей, которое приводит к подавлению экспрессии гена. При этом возникает состояние, аналогичное структурному повреждению гена, которое получило название функциональной инактивации [2]. Структурные и функциональные повреждения генов-супрессоров приводят к нарушению путей регуляции клеточного цикла ЯБ1/р16(ШК4А), АРС/Р-катенин/Ге/и р53/р14(АЯГ)/МОМ2, стимулируя неконтролируемый рост клеток и образование опухолей. Аномальное метилирование промоторных районов, вызывающее инактивацию
Принятые сокращения: МЧ-ПЦР - метилчувствительная по-
лимеразная цепная реакция; РМЖ - рак молочной железы.
* Эл. почта: valzem@mail.com
гена, может служить маркером опухолей определенного типа.
Поэтому изучение частоты метилирования генов, обладающих супрессорной функцией, в опухолях различного типа важно и необходимо для понимания роли этих генов в канцерогенезе. Значительный рост числа генов, инактивация которых обусловлена гиперметилированием промоторных областей, привел к попытке определить набор генов, метилирование которых характерно только для опухолей определенного вида. Специфический профиль метилирования, так называемый "метилотип", при раке желудка и кишечника включает гены р16/СБКИ2А, р14/АЯ¥, ЫвЫТ, АРС и ЫЬИ1, при опухолях легкого - БАРК, МБИТ, р16/СОКЫ2А [3]. В большинстве случаев выявляют единичные гены, гиперметилированные в опухолях определенного типа: АРС и МЬИ1 - при колоректальном раке [4, 5], р14(АЯ¥) - при раке желудка [6], р15 - при злокачественных заболеваниях крови [7], ОБТР1 - при злокачественных новообразованиях печени [8].
"Метилотип" рака молочной железы (РМЖ) окончательно не определен, но ведется активное
изучение метилирования различных генов при спорадическом РМЖ, в частности, установлено метилирование генов 14-3-3а[9], АРС [10], FHIT[11, 12], SYK [13], RASSF1A [14], SLIT2 [15], SRBC [16].
Для определения профиля метилирования в спорадическом РМЖ мы изучили метилирование генов RB1, p16/CDKN2A, p15/CDKN2B, p14/ARF, CDH1, MGMT, HIC1 и N33, играющих важную роль в регуляции деления и пролиферации клеток. Первые четыре гена относятся к основным регуляторам клеточного цикла, ген MGMT участвует в репарации, ген CDH1 связан с инвазией и метастазированием опухолей, а гены HIC1 и N33 имеют высокий уровень метилирования в различных новообразованиях. Аномальное метилирование CpG-островка в промоторной области приводит к инактивации этих генов в опухолях различного типа [17]. В неизмененных тканях аномальное метилирование этих генов не выявлено [18].
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Образцы РМЖ получены от 105 больных РМЖ, прооперированных в ГУ РОНЦ РАМН им. H.H. Блохина. Сразу после удаления опухоли образцы тканей замораживали и хранили в жидком азоте. Все опухоли классифицированы по TNM согласно требованиям Международного противоракового союза (UICC, версия 1989 г.). Профиль метилирования генов RB1, p16/CDKN2A, p15/CDKN2B, p14/ARF, CDH1, MGMT, HIC1 и N33 определяли в тканях РМЖ, а также в неизмененной ткани молочной железы (пять образцов секционного материала) и в ДНК из лимфоцитов пе-
риферической крови здоровых доноров (30 образцов).
Геномную ДНК выделяли с использованием фенол-хлороформной экстракции [19]. Метилирование Срв-островков промоторных областей определяли с помощью метилчувствительной по-лимеразной цепной реакции (МЧ-ПЦР). Метод МЧ-ПЦР основан на способности метилчувстви-тельных рестриктаз гидролизовать ДНК, не содержащую модифицированных оснований, и оставлять негидролизованными участки, содержащие метилцитозин. В качестве матрицы для ПЦР использовали гидролизованную метилчувстви-тельными рестриктазами Нра11 (ССвв) либо ННа\ (вСвС) ДНК из опухолевой и нормальной ткани молочной железы и из лимфоцитов периферической крови здоровых доноров [20]. Гено-мую ДНК (1 мкг) обрабатывали 10 ед.акт. рест-риктазы в 10 мкл инкубационной смеси в течение ночи. Для амплификации использовали 150 нг ги-дролизованной ДНК. При проведении ПЦР учитывали присутствие сайтов узнавания используемых рестриктаз в амплифицируемом фрагменте, который содержал не менее трех-четырех Нра11-или Нйа1-сайтов (табл. 1). Метилирование гена р14 анализировали с использованием рестрикта-зы ННа\, других генов - Нра11. В случае модификации цитозинов в метилцитозин ДНК не расщепляется, и продукт ПЦР может быть выявлен в геле. В отсутствие метилирования ДНК полностью гидролизуется, и продукт ПЦР не образуется. Нуклеотидные последовательности праймеров и условия ПЦР приведены в ранее опубликованных работах [21-26].
Таблица 1. Количество анализируемых CpG-динуклеотидов в промоторных областях генов
Ген Количество Hpaïi- и HhaI-сайтов в анализируемом фрагменте гена* Количество CpG-пар в анализируемом фрагменте Доля проанализированных CpG-пар (%)
HpaII HhaI
p16 6 (6) 2 (3) 50 6/50 (12%)
p14 1 (1) 6 (8) 33 8/33 (24%)
p15 5 (5) 5 (6) 33 5/33 (15%)
RB1 4 (4) 3 (4) 29 4/29 (14%)
MGMT 10 (10) 16 (20) 78 10/78 (13%)
N33 9 (9) 9 (14) 46 9/46 (19%)
HIC1 7 (7) 2 (2) 31 7/31 (22%)
Ing1-1b 7 (7) 5 (7) 42 7/42 (17%)
* В скобках указано количество СрО-пар в сайтах рестрикции; количество проанализированных участков узнавания рестриктаз и содержащихся в них СрО-пар подчеркнуто.
3 4 5 6 7 M
1щ1-1Ь (416 п.н.) ^ " * ^ р16 (349 п.н.)
¡^■ь^е^Ь^бжЕЭСГЭ^^-Я (253 п.н.)
Рис. 1. Анализ метилирования промоторной области гена р16.1 - Отрицательный контроль; 2, 5 - отсутствие метилирования; 3, 4, 6 - метилирование промоторной области гена р16; 7 - положительный контроль (негидролизованная ДНК); М - маркер молекулярного веса.
С целью исключения ложноположительных и ложноотрицательных результатов проводили мультилокусные ПЦР с тремя парами праймеров: один фрагмент принадлежал изучаемому гену, а два других служили положительным и отрицательным контролями. Полноту гидролиза ДНК оценивали путем МЧ-ПЦР фрагмента гена Ing1-1b, содержащего сайты узнавания рестриктаз Hpall и Hhal, не метилированного ни в нормальных, ни в опухолевых тканях. Внутренним контролем ПЦР служил фрагмент восьмого экзона гена Ext2, не содержащий сайтов узнавания указанных рестриктаз (табл. 2). Продукты ПЦР разделяли в 8%-ном полиакриламидном геле и окрашивали нитратом серебра [20] (рис. 1).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
С использованием мультилокусной МЧ-ПЦР нами изучен профиль метилирования CpG-ост-ровков в промоторных областях генов RB1, p16/CDKN2A, p15/CDKN2B, p14/ARF, CDH1, MGMT, HIC1 и N33 в 105 образцах РМЖ.
Обнаружен высокий уровень метилирования промоторов основных генов-супрессоров, участвующих в регуляции клеточного цикла по сигнальному пути Cdk-Rb-E2F: RB1 - 18 случаев из 105 (17%) и p16 - 59/105 (56%), в 13 образцах РМЖ метилированы оба гена. В то же время CpG-ост-ровок гена p15, вовлеченного в тот же регулятор-
ный путь, метилирован только в двух образцах (2%), причем в них метилированы и p16, и RB1, что может указывать на полное нарушение регу-ляторного пути Cdk-Rb-E2F в этих образцах РМЖ.
Метилирования CpG-островка гена p14, про-моторная область и первый экзон которого расположены между генами p15 и p16, нами не обнаружено. Можно предположить, что метилирование геновр14,р15 ир16 происходит, скорее всего, независимо друг от друга и не приводит к инактивации всего локуса 9р21. В то же время анализ потери гетерозиготности в опухолях различного типа выявляет делеции всего района 9р21 [27-29].
Достаточно высокий уровень метилирования обнаружен в промоторной области гена CDH1 -39/105 (37%), а самый высокий - в промоторной области гена HIC1 - 83 случая из 105 (79%). Уровень метилирования CpG-островков генов MGMT и N33 не превышал 8% (8/105) и 9% (9/105) соответственно.
Таким образом, обнаружено метилирование всех изученных генов, за исключением p14/ARF. Ни в одном случае не установлено одновременного метилирования всех восьми генов, а в 12 образцах (
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.