МИКРОБИОЛОГИЯ, 2015, том 84, № 5, с. 529-535
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
АНТИФУНГАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ WICKERHAMOMYCES SILVICOLA
© 2015 г. В. И. Голубев1
Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимиии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук, Пущино
Поступила в редакцию 12.02.2015 г.
Обнаружен штамм Wickerhamomyces silvícola ВКМ Y-178, секретирующий микоцин фунгицидного действия. Наибольшую активность он проявляет при значении рН 4.5 и повышенном осмотическом давлении среды. К микоцину чувствительны более 140 видов 45 родов аскомицетных дрожжей, ба-зидиомицетные к нему нечувствительны. Как правило, такономически гомогенные виды также гомогенны и по реакции к микоцину.
Ключевые слова: дрожжи, микоциногения, киллер-токсин, таксономия.
DOI: 10.7868/S0026365615050109
Секреция антифунгальных (глико)пептидов (микоцинов, киллер-токсинов) широко распространена среди дрожжевых грибов (Голубев, 2012) и известна у нескольких видов рода Wickerhamomyces Kurtzman et al., в том числе у W. anomalus (Hansen) Kurtzman et al. (=Hansenula anomala (Hansen) H. et P. Sydow = Pichia anomala (Hansen) Kurtzman). Микоциногенные его культуры предложено использовать для типирования возбудителей кандидозов и подавления грибов, портящих корма и пищевые продукты (Passoth et al., 2011; Druvefors et al., 2005).
Большинство микоциногенных штаммов W. anomalus активны против почти всех видов своего рода (Голубев, 2015). Устойчивым к ним оказался лишь типовой штамм W. silvicola (Wickerham) Kurtzman et al. (=Hansenula silvicola Wickerham = Pichia silvicola (Wickerham) Kurtzman), BKM Y-178, что позволило предположить наличие у него микоциногенной активности. Последующая проверка это подтвердила.
Цель настоящей работы — изучить условия для экспрессии указанным штаммом фунгицидной активности, исследовать спектр действия и другие характеристики секретируемого им микоцина.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Все использованные в работе штаммы поддерживаются во Всероссийской коллекции микроорганизмов (http://www.vkm.ru/), вследствие чего
1 Автор для корреспонденции (e-mail: wig@ibpm.pushchi-
no.ru).
далее аббревиатура (BKM Y-) перед их номерами не приводится.
Для тестирования на чувствительность к микоцину использован глюкозо-пептонный агар (г/л): глюкоза — 5, пептон — 2.5, дрожжевой экстракт — 2, агар — 20, на который наносили 0.05 мл суспензии (примерно 105 клеток/мл) обследуемых 2—3-сут культур, выращенных на сусло-агаре, тщательно растирали шпателем и затем штрихом наносили обильный инокулюм 3-4-сут культуры токсино-образующего штамма 178. Засеянные чашки инкубировали при комнатной температуре до появления роста газона. При формировании вокруг штамма 178 зоны подавления роста шириной несколько миллиметров посеянная газоном культура регистрировалась как чувствительная, если ширина зоны не превышала 1—2 мм, то такие штаммы относили к слабо чувствительным. При отсутствии зоны ингибирования роста исследуемых дрожжевых грибов, штаммом 178, их относили к нечувствительным.
Для наработки внеклеточного токсина штамм 178 выращивали в статическом режиме в течение 3 сут в глюкозо-пептонной среде того же состава, но неагаризованной. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин) и супернатант фильтровали через стеклянные фильтры GF/A ("Sigma", США). Токсин-содержащую культуральную жидкость использовали для проверки устойчивости токсина к повышенной температуре и действия токсина на жизнеспособность чувствительных клеток определяли при их инкубации в культуральной жидкости с последующим высевом на сусло-агар и подсчетом числа КОЕ.
100 80 60 40 20
0
4
Часы
Гибель клеток Wickerhamomyces canadensis 1395 (% жизнеспособных) при инкубации в микоцин-со-держащей культуральной жидкости Wickerhamomyces silvicola 178.
Для ориентировочной оценки молекулярной массы токсина штамм 178 выращивали на покрытой диализной мембраной ("Spectrum", США) на среде выше указанного состава и используемой для тестирования чувствительности. После 7 сут инкубации мембрану вместе с выросшей на ней культурой с агаризованной среды удаляли и засевали ее газоном чувствительного к токсину штамма W. canadensis 1395.
В целях элиминации антифунгальной активности суспензию (0.1 мл, 104 кл./мл) штамма 178 высевали на сусло-агар и инкубировали при максимальной для его роста температуре (35°С). В другом варианте чашки 3—6 мин облучали УФ (254 нм, ~200 Дж/м2).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Антифунгальная активность у штамма 178 обнаруживалась в диапазоне значениий рН среды от 3.5 до 6.0. При крайних значениях этого диапазона активность была слабой, а при рН 6.5 и выше отсутствовала. Наибольшие зоны подавления роста чувствительных культур формировались при рН 4.5. Ширина их значительно увеличивалась при введении в среду 3% №С1 и еще более возрастала при 5%. Однако при второй концентрации сильно замедлялся рост культур, вследствие чего при обследовании чувствительности видов дрожжей к продуцируемому W. silvicola 178 агенту был использован глюкозо-пептонный агар с цитрат-фосфатным буфером (рН 4.5), и с внесением 3% №С1. Следует отметить, что второй штамм W. silvicola 2191, описанный как Endomycopsis muscicola №ка8е е! Коша§а1а, указанной активностью не обладает и, более того, чувствителен к агенту, секретируемому штаммом 178. Эта пара штаммов может быть полезна при идентифика-
ции генов, ответственных за синтез антифунгаль-ного агента.
Секретируемый штаммом 178 токсин полностью инактивировался после 5-мин прогревания при 100°C. Он не диффундирует через диализную мембрану (Spectrum, США), не пропускающую соединения с молекулярной массой около 8 кДа и более. Этот агент обладает фунгицидным действием: примерно половина чувствительных клеток гибнет после 1—2 ч инкубации с ним и почти все — спустя 4—5 ч (рисунок).
Синтез антифунгального токсина у штамма 178 детерминирован, очевидно, хромосомными генами, поскольку воздействия, элиминирующие внехромосомные элементы, были для него неэффективны. После инкубации штамма при максимальной для его роста температуре (35°C) и УФ-облучения среди более 120 случайно отобранных колоний не обнаружено ни одной утратившей активность.
Действие агента, секретируемого штаммом W. silvicola, обследовано на более, чем 220 видах дрожжей 86 родов. Чувствительность их к нему оказалась таксоноспецифична. Он не активен против Schizosaccharomyces pombe (класс Schizosaccharo-mycetes), представителей 23 родов базидиомицет-ных дрожжевых грибов, принадлежащих к классам Agaricostilbomycetes, Cystobasidiomycetes, Exobasidi-omycetes, Macrobotryomycetes и Tremellomycetes (табл. 1), проявляя активность лишь против аско-мицетных дрожжей класса Saccharomycetes. Совокупность таких характеристик продуцируемого штаммом W. silvicola антифунгального агента как таксономическая специфичность чувствительности к нему, термолабильность, значительная молекулярная масса и условия проявления активности позволяет отнести его к микоцинам (Голубев, 2012).
Спектр действия микоцина штамма W. silvicola довольно широк и включает более 140 видов 45 родов аскомицетных дрожжей порядка Saccha-romycetales. Чувствительны к нему почти все представители семейства Wickerhamomycetaceae (табл. 2). Количество чувствительных видов в других семействах, особенно филогенетически отдаленных, снижается и возрастает число слабо чувствительных (табл. 3—7).
Штаммы одного вида, как правило, однотипны по реакции к микоцину штамма W. silvicola (например, B. californica, C. odintsovae, C.parapsilo-sis, C. quercuum, C. solani, L. kononenkoe, L. lipofer, M. guilliermondii, N. commutata, N. fulvescens, P. nor-vegensis, St. amethionina, W. canadensis, W. strasbur-gensis). Встречаются, однако, и гетерогенные в этом отношении таксоны (Cyb. saturnus, L. thermo-tolerans, L. starkeyi, L. tetrasporus, P. fermentans, P. kluyveri, P. manshurica, P. membranifaciens, S. starkeyi-henricii, W. anomalus, W. subpelliculosus),
2
6
8
Таблица 1. Роды, виды которых нечувствительны к микоцину Wickerhamomyces silvicola (количество обследованных
видов, штаммов)
Aciculoconidium (1, 1) Filobasidium (1, 1) Pachysolen (1, 1)
Ambrosiozyma (1, 1) Holtermannia (1, 1) Priceomyces (1, 1)
Babjeviella (1, 1) Hyphopichia (1, 1) Rhodosporidium (1, 1)
Blastobotrys (1, 1) Kloeckera (1, 1) Rhodotorula (1, 1)
Bulleromyces (1, 1) Kockovaella (1, 1) Sakaguchia (1, 1)
Citeromyces (1, 1) Kodamaea (1, 1) Schizosaccharomyces (1, 2)
Cyptococcus (1, 1) Komagataella (1, 1) Sirobasidium (1, 1)
Curvibasidium (1, 1) Kondoa (1, 1) Sporidiobolus (1, 1)
Cystofilobasidium (1, 1) Kurtzmanomyces (1, 1) Sympodiomycopsis (1, 1)
Dioszegia (1, 1) Kwoniella (1, 1) Tolulaspora (3, 3)*
Eremothecium (1, 1) Leucosporidium (2, 2) Trimorphomyces (1, 1)
Fellomyces (1, 1) Magnusiomyces (1, 1) Wickerhamiella (1, 1)
Fibulobasidium (1, 1) Millerozyma (1, 1) Yamadazyma (1, 1)
Filobasidiella (2, 2) Mrakia (1, 1)
* Слабо чувствительна T. delbrueckii (1).
Таблица 2. Спектр действия микоцина Wickerhamomyces silvicola внутри семейства Wickerhamomycetaceae, включая филогенетически родственные виды Candida
Barnettozyma californica 838T, 2553 + Cyb. veronae 2163 +
B. pratensis 2136T + Starmera amethionina 2614T, 2615 +
B. salictaria 1288T + S. pachycereana 2616T, 2617 +
Candida odintsovae 2024—2027 + W. alni 2509T, 2510 +
C. silvicultrix 2189T + W. anomalus* 1086T -
C. quercuum 2157T, 2739 + W. bisporus 1065T +
C. solani 69T, 2334, 2335 + W. bovis 1106T +
Cyberlindnera americana 1409T + W. canadensis 1395T, 1398-1400 +
Cyb. bimundalis 1407T + W. chambardii 276 +
Cyb. fabianii 1450T + W. ciferri 169Т -
Cyb. jadinii 768 + W. lynferdii 2205T +
Cyb. mrakii 173T - W. mucosus 2086T -
Cyb. petersonii 1410 + W. pijperi 310T +
Cyb. rhodanensis 277 + W. rabaulensis 2197T +
Cyb. sargentensis 2087T + W. silvicola 2191 +
Cyb. saturnus 2552HT - W. strasburgensis 278, 1387, 2746 +
1084, 1403, 2551 c W. subpelliculosus 180T +
Cyb. suaveolens 2990T + 1091 с
Cyb. subsufficiens 2220T c 1085, 1088, 1089, 1090 -
W. sydowiorum 2192 +
+ Чувстви
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.