МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 2, с. 201-206
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.017.23:577.152
АНТИФУНГАЛЬНЫЙ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИД, СЕКРЕТИРУЕМЫЙ ЭПИФИТНЫМИ ДРОЖЖАМИ PSEUDOZYMA GRAMINICOLA
© 2008 г. В. И. Голубев*1, Т. В. Кулаковская*, А. С. Шашков**, Е. В. Кулаковская*, Н. В. Голубев***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Институт органической химии им. НД. Зелинского РАН, Москва ***Химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва
Выделенные с растений дрожжи Pseudozyma graminicola подавляют рост почти всех исследованных ас-комицетов и базидиомицетов (более 270 видов около 100 родов), включая патогенные виды. Секретиру-емый ими фунгицидный агент идентифицирован как гликолипид, состоящий из остатка целлобиозы с двумя О-заместителями (ацетил и 3-гидроксикапроновая кислота) и 2,15,16-тригидроксипальмитиновой кислоты. Выход АТФ из клеток, обработанных этим гликолипидом, свидетельствует о нарушении им проницаемости цитоплазматической мембраны. Базидиомицеты к целлобиозолипиду более чувствительны, чем аскомицеты.
Ключевые слова: антагонизм, биоконтроль, гликолипид, фунгицид, Ustilaginales.
Дрожжевые грибы, будучи сапротрофами, в природе наиболее многочисленны на растениях и растительных остатках. В филлосфере численность их может достигать свыше 0.5 млн. клеток/г и нередко они составляют преобладающую часть микобиоты [1]. В противоположность бытующему представлению об эпифитных дрожжах как нейтральных комменсалах результаты исследований последних лет свидетельствуют, что они способны секретировать антифунгальные вещества [2] и вносить тем самым вклад в защиту растений от патогенных грибов [3].
Одними из распространенных в филлоплане базидиомицетных дрожжевых грибов являются виды Pseudozyma Bandoni emend. Boekhout, анти-фунгальная активность которых может быть обусловлена образованием ими как гликолипи-дов [2], так и микоцинов [4]. Представители данного рода, помимо видов Bullera Derx, Cryptococ-cus Vuillemin, Rhodotorula Harrison и Sporobolomy-ces Kluyver et van Niel, обнаружены нами при обследовании пастбищных трав (вика, ежа, клевер, козлятник, люцерна, овсяница, райграс, тимофеевка), на которых численность пропагул ми-целиальных грибов при высеве на ГПА колебалась от 5 до 84, дрожжевых - от 6 до 95 тыс./г. Три изолята Pseudozyma (Ll-16, -41 и -71) были идентифицированы нами как P. fusiformata (Buhagiar) Boekhout [5], а два других (Ll-20 и -46) описаны как новый вид, P. graminicola Golubev et al. [6]. Последующее изучение последнего выявило, что культуры его обладают антифунгальной актив-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: wig@ibpm.pushchino.ru).
ностью. Условия ее проявления, химическая природа фунгицидного фактора и спектр чувствительных к нему организмов охарактеризованы в данной работе.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы и-20 Y-2938) и Ы-46 выделены
со злаковых трав, собранных в Мытищенском районе Московской обл. в июне 2002 г., при высеве проб на глюкозо-пептонный агар (ГПА) с пенициллином (1 млн. ед./л) или стрептомицином (1 г/л). Выделенные культуры поддерживали пересевами на сусло-агаре (СА) и хранении при 5°С. Антифун-гальная активность изолятов тестировалась в основном на штаммах Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, http://www.vkm.ru).
Тестирование чувствительности выращенных на СА (20°С) трехсуточных культур проведено методом "культура против культуры" на ГПА с цитрат-фосфатным или сукцинат-натриевым буфером (рН 4.0) с инкубацией при комнатной температуре [7]. Выживаемость дрожжей после инкубации с выделенным антифунгальным агентом оценивали путем высева разведений клеточных суспензий на ГПА и подсчета выросших колоний.
Элиминация антифунгальной активности. 0.1 мл
клеточной суспензии (104 клеток/мл) штаммов Ll-20 и Ll-46 высевали газоном на СА и инкубировали при 35°С. Через две недели появившиеся случайно отобранные колонии были проверены на наличие антифунгальной активности.
Получение, выделение и очистка антифунгаль-ного агента. Указанные два штамма выращивали 4 недели в покое при 24°С в среде, содержащей (г/л) глюкозу - 10.0, (NH4)2SO4 - 1.0, дрожжевой экстракт - 0.5, MgSO4 ■ 7 H2O - 0.05, Na2HPO4 ■ 12 H2O -13.8, моногидрат лимонной кислоты - 6.45, рН - 4.0. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 30 мин), супернатант фильтровали через сгеклобу-магу GF/A ("Whatman", Великобритания) и лиофи-лизировали. Полученный из 3 л культуральной жидкости лиофилизат в течение 4-5 сут выдерживали в 400-500 мл (4°С) метанола, нерастворившие-ся компоненты отделяли с помощью стеклянного фильтра и метанольный экстракт упаривали на роторном испарителе (40-50°С). При двукратном уменьшении его объема выпавшие в осадок соли отфильтровывали, фильтрат упаривали почти досуха, добавляли 250 мл деионизованнй воды и оставляли на сутки (4°С). Выпавший осадок отделяли на стеклянном фильтре, дважды промывали деионизо-ванной водой (4°С) и растворяли в 15-20 мл метанола. На каждом этапе получаемые препараты проверяли на наличие антифунгальной активности, для чего 10-50 мкл растворов препаратов наносили на диски фильтровальной бумаги диаметром 5 мм, высушивали и помещали на поверхность ГПА (рН 4.0), засеянного газоном Cryptococcus terreus BKM Y-2253. Чистоту препаратов оценивали с помощью тонкослойной хроматографии в системе - хлороформ : метанол : вода (4 : 4 : 0.2) на пластинках Kiesegel 60 F254 ("Merck", Германия), которые проявляли обработкой 5% H2SO4 в 95% этаноле при 100°С.
Метанолиз. Метанольный раствор 20-100 мг препарата высушивали в токе азота. К сухому остатку добавляли 6-8 капель ацетилхлорида, 1-1.5 мл метанола (4°C) и проводили гидролиз (1 ч, 90°С). Гидролизат под вакуумом упаривали досуха, промывали 2-3 мл гексана и оставшуюся часть растворяли в 1-2 мл смеси хлороформа с метанолом (1 : 1). Полученный раствор хромато-графировали на указанных выше пластинках и в той же системе.
ЯМР- и масс-спектроскопия. ХН- и 13С-ЯМР-спектры препаратов, высушенных под током азота и растворенных в пиридине-й5, сняты на спектрометре Bruker DRX-500 (Германия) при использовании в качестве внутреннего стандарта TMS. Для снятия двумерных спектров (COSY, TOCSY, HSQC, HMBC) использовали стандартные методики фирмы "Bruker" (XWINNMR 1.2). Время смешивания в эксперименте TOCSY составляло 0.1 с. Эксперимент НМВС был оптимизирован для константы JCH 8 Гц.
Определение молекулярной массы в положительных и отрицательных ионах растворенных в метаноле препаратов проводили на масс-спектрометре LCO DECAXP ("Thermo Finnigan", San José, Калифорния, США).
Онределение АТФ оcyщеcтвляли люминомет-рическим методом [8].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наличие антифунгальной активности у штаммов Ll-20 и Ll-46 было выявлено при скрининге полученных изолятов с использованием ГПА (рН 4.5) и C. terreus BKM Y-2253 в качестве тест-культуры. Эта активность проявлялась при значениях рН среды в диапазоне от 3.5 до 5.0. Наибольшие зоны отсутствия роста вокруг штрих-культур Ll-20 и Ll-46 наблюдались при рН 4.0-4.5 как на ГПА, так и на СА независимо от состава буфера (цитрат-фосфатный или сукцинат-натриевый). Увеличение ширины зон наблюдалось при снижении в ГПА концентрации источника азота (пептон или (NH4)2SO4) и повышении концентрации глюкозы. Антифунгаль-ный агент образуется также в жидких средах при культивировании штаммов как в покое, так и на качалке (150 об./мин).
Секретируемый P. graminicola агент обладает чрезвычайно широким спектром действия. Почти все протестированные 377 штаммов аскомицетных и базидиомицетных грибов, принадлежащие к 268 видам 95 родов, были к нему чувствительны (табл. 1). Устойчивыми оказались лишь виды Bullera hannae, Cryptococcus nemorosus, C. perniciosus, Dacrymyces stillatus, Neovossia setariae, Sporobolomy-ces singularis, а также отдельные штаммы C. humico-la и Ustilago maydis.
К настоящему времени известны два типа анти-фунгальных веществ, секретируемых дрожжами: микоцины и гликолипиды [2]. Первые белковой природы и в отличие от вторых обладают таксоно-специфичными спектрами действия. Проявление активности антифунгального агента P. graminicola против почти всех протестированных как аскомицетных, так и базидиомицетных грибов (табл. 1), указывает на его принадлежность к гликолипидам. В пользу этого свидетельствует также экстрагируе-мость его метанолом и нерастворимость в воде.
После инкубации рассевов штаммов Ll-20 и Ll-46 при максимальной для их роста температуре (35°С), что эффективно элиминирует внехромосомные генетические элементы, вырастают колонии как с ровным, так и с ризоидным краем. Последние характеризуются более интенсивным формированием мицелия. Проверка свыше 70 колоний обоих типов показала, что все они сохранили антифунгальную активность, хотя, судя по ширине зон подавления роста, различались по уровню активности. Отсутствие элиминантов предполагает хромосомную локализацию у P. graminicola генов, детерминирующих синтез антифунгального агента. Синтез же микоцинов нередко обусловлен наличием в клетках вирусов или плазмид [2].
АНТИФУНГАЛЬНЫЙ ЦЕЛЛОБИОЗОЛИПИД
203
Полученные очищенные препараты антифун-гального вещества, секретируемого P. graminicola, при тонкослойной хроматографии в указанной системе давали одно пятно с Rf 0.75. Выход его при использованных условиях культивирования составлял 20-25 мг/л культуральной жидкости. Ме-танольные растворы препаратов, хранившиеся при 4°С, были активны в течение не менее 1.5 лет.
После метанолиза в гидролизате антифунгаль-ного препарата обнаружены два дополнительных пятна, одно из которых по подвижности соответствует глюкозе, а другое, с молекулярной массой (341 Да), соответствует метиловому эфиру жирной С16 тригидроксикислоты. Согласно результатам масс-спектрометрии, само секретируемое P. graminicola соединение обладает молекулярной массой 783.8 Да.
В 13С-ЯМР-спектре очищенного препарата P. graminicola присутствуют два сигнала аномер-ных атомов углерода углеводных остатков (8С 105.0 и 102.2), три сигнала CO-групп (8С 179.6, 172.3 и 171.25), групп CH3CO (8С 20.9) и CH3-C (8С 14.4),
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.