научная статья по теме АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА BACILLUS MEGATERIUM Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА BACILLUS MEGATERIUM»

МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 2, с. 196-204

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ СТАТЬИ

УДК 579.61

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ ВИДА BACILLUS MEGATERIUM

© 2012 г. И. А. Маланичева*, Д. Г. Козлов*, И. Г. Сумарукова*, О. В. Ефременкова*, 1, В. А. Зенкова*, Г. С. Катруха*, М. И. Резникова*, О. Д. Тарасова**, С. П. Синеокий**, Г. И. Эль-Регистан***

*Учреждение РАМН Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН, Москва **ФГУПГосударственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва ***Учреждение Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва

Поступила в редакцию 07.04.2011 г.

Из почвы выделена бактерия, проявившая высокий уровень антимикробной активности, и установлена ее принадлежность к виду Bacillus megaterium. Дополнительно исследовано образование антибиотиков у девяти штаммов этого вида из коллекции ВКПМ. Установлено, что при глубинном культивировании в общей сложности у девяти из десяти различных штаммов B. megaterium образуются антибактериальные антибиотики, отличающиеся по спектру действия. Описаны физико-химические свойства пяти соединений, из которых три отнесены к группе антибиотиков-пептидов. Все пять соединений эффективны в отношении метициллин-резистентного штамма Staphylococcus aureus ИНА 00761, и показано, что три из них относятся к ранее неописанным соединениям. Кроме того, антибиотики из разных штаммов B. megaterium проявляют активность в отношении устойчивого к гликопептидным антибиотикам штамма Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177, а также к грамотрицательным бактериям Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 и Escherichia coli ATCC 25922.

Ключевые слова: Bacillus megaterium, антибактериальные антибиотики, продуценты антибиотиков, MRSA, устойчивость к гликопептидным антибиотикам.

В связи с широким распространением форм патогенных микроорганизмов, устойчивых к используемым в медицинской практике антибиотикам, актуальным является поиск новых соединений, преодолевающих устойчивость микроорганизмов к лекарственным веществам. Известно, что основными продуцентами антибиотиков являются почвенные микроорганизмы, к которым, наряду с актиномицетами и грибами, относятся эубактерии, в том числе представители рода Bacillus [1, 2]. Среди антибиотиков, образуемых бациллами, в настоящее время в медицинской практике используются такие антибиотики, как первый отечественный антибиотик грамицидин S, образуемый B. brevis [3], и полимиксины М и В, образуемые B. polymyxa [4].

В рамках программы по изысканию новых природных антибиотиков, преодолевающих лекарственную устойчивость патогенных бактерий, нами был выделен из почвы штамм, депонированный впоследствии в коллекции Института по изысканию новых антибиотиков под номером

1 Автор для корреспонденции (e-mail: ovefr@narod.ru).

ИНА 01083. Этот штамм привлек наше внимание в связи с проявляемой им антимикробной активностью в отношении тест-культур бактерий, устойчивых к бета-лактамным и гликопептидным антибиотикам. Целью настоящей работы было идентифицировать видовую принадлежность бактерии ИНА 01083, расширить круг исследуемых представителей этого вида за счет коллекционных штаммов и описать образуемые ими антибиотики.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Штамм ИНА 01083 был выделен из образца выщелоченного чернозема Краснодарского края [5]. После определения видовой принадлежности другие штаммы этого вида получены из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов: ВКПМ В-600, ВКПМ В-602, ВКПМ В-603, ВКПМ В-608, ВКПМ В-607, ВКПМ В-604, ВКПМ В-605, ВКПМ В-606, ВКПМ В-4801, ВКПМ В-44-2, ВКПМ В-402. В качестве тест-культур для определения антимикробной активности использова-

ли следующие микроорганизмы: грамположи-тельные бактерии — Bacillus subtilis АТСС 6633, B. pumilis NCTC 8241, B. mycoides 537, Micrococcus lu-teus NCTC 8340, Leuconostoc mesenteroides ВКПМ B-4177, Staphylococcus aureus FDA 209P (MSSA), S. aureus ИНА 00761 (MRSA), грамотрицательные бактерии — Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, и грибы—Aspergillus niger ИНА 00760, Saccharomyces cerevisiae RIA 259.

Условия культивирования. Для поверхностного культивирования всех перечисленных выше штаммов использовали модифицированную агаровую среду № 2 Гаузе следующего состава (%): глюкоза — 1, пептон — 0.5, триптон — 0.3, NaCl — 0.5, агар — 2; рН 7.2—7.4. Для глубинного культивирования использовали среды (%): (1) картофель — 2.0; (2) солодовый экстракт (Maltax, Финляндия) — 2.0; (3) (полноценная среда № 2 Гаузе) глюкоза — 1, NaCl — 0.5, пептон — 0.5, триптон — 0.3; (4) (среда № 802) пептон — 0.5, триптон — 0.3, дрожжевой экстракт — 0.2, MgSO4 • 7H2O — 0.1; (5): глюкоза — 1, гороховая мука — 5, пептон — 0.5, NaCl - 0.5; (6) маннит - 1, NaCl - 0.5, пептон -0.5, триптон - 0.3; (7) (NH4)2SO4 • 7H2O - 0.4, NaCl - 1, мел - 0.6, мука пшеничная - 5; (8) соевая мука - 5, крахмал - 2, (NH4)2SO4 - 0.2, мел -0.2; (9) глюкоза - 1, глицерин - 0.25, пептон -2.5, соевая мука - 1, NaCl - 0.3.

Глубинное культивирование штаммов B. mega-terium осуществляли в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды, на качалке (220 об/мин). Штаммы B. megaterium, а также тест-культуры L. mesenteroides, A. niger и Sac. cerevisiae, выращивали при температуре 28°С, другие тест-культуры -при 37°С.

Определение антимикробной активности. Антимикробную активность определяли методом диффузии в агар на среде № 2 Гаузе, для чего культу-ральную жидкость помещали в лунки диаметром 9 мм, а выделенные вещества или фракции веществ закапывали на бумажные диски диаметром 6 мм, которые подсушивали и помещали на агаровую среду, инокулированную тест-культурой. Об уровне антимикробной активности судили по диаметрам зон задержки роста тест-культур вокруг лунок или дисков.

Микроскопические наблюдения. Микроструктуру исследовали с помощью светового микроскопа Olympus BX41TF (Япония). При окрашивании по Граму в качестве положительного и отрицательного контроля использовали штаммы B. subtilis АТСС 6633 и E. coli ATCC 25922 соответственно.

Выделение ДНК. Для выделения ДНК из клеток B. megaterium INA 01083 использовали суточную агаровую культуру. Выделение проводили согласно методу Булыгиной с соавт. [6]. ПЦР гена 16S рРНК и секвенирование полученных продуктов проводили с использованием системы универсальных праймеров [7]. Состав реакционной смеси для ПЦР: праймеры — по 25 пмолей; 10х буфер — 2.5 мкл; 2 мМ dNTP — 2.5 мкл; поли-мераза BioTaq ("Диалат", Москва) 5 Ед/мкл — 0.2 мкл; ДНК-матрица — 50 нг; вода — до 25 мкл. ПЦР проводили по следующей схеме: 30 циклов при: 94°С - 0.5 мин; 45°С - 1 мин; 72°С - 1 мин; окончательная полимеризация — 7 мин.

Анализ продуктов ПЦР. Анализ проводили электрофоретически в 2% агарозном геле при напряженности электрического поля 6 В/см. Фотографирование осуществляли с помощью системы видеодокументации BioDocII ("Biometra", Германия). Выделение и очистку продуктов ПЦР, соответствующих различным областям гена, проводили из легкоплавкой агарозы с применением набора реактивов Wizard PCR Preps ("Promega", США) согласно рекомендациям производителя. Секвенирование ПЦР-продуктов проводили с использованием набора реактивов Silver Sequencing (Promega, США) согласно рекомендациям производителя. При этом для секвенирования использовали как внешние, так и внутренние праймеры, чтение проводили в двух направлениях.

Анализ последовательностей 16S рРНК проводили с помощью данных и программного обеспечения Ribosomal Database Project — RDP (http://rdp.cme.msu.edu). Редактирование последовательностей проводили с помощью редактора BioEdit (http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/Bio-Edit/bioedit.html). Последовательности выравнивали с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение бескорневого филогенетического дерева исследуемой бактерии проводили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECONW (http://bioc-www.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html).

Выделение, очистка и описание физико-химических свойств антибиотиков. Антибиотики выделяли из культуральной жидкости сорбцией на Ам-берлите ХАD-2 и десорбцией смесью растворителей: н-бутанол—ацетон—вода (1 : 1 : 1). Хроматографическую очистку антибиотиков проводили на колонках Кизельгель 60, используя системы растворителей: хлороформ-метанол (95 : 5 и 9 : 1) и толуол—метанол (9 : 1). Фракции с колонок проверяли на биологическую актив-

ность в отношении B. subtilis АТСС 6633 и S. aureus ИНА 00761 (MRSA).

Кислотный гидролиз выделенных антибиотиков проводили в 6 н HCl при 105°С в течение 18 ч с последующим хроматографированием на бумаге в системах н-бутанол—уксусная кислота—вода (4 : 1 : 5) (верхний слой) и н-бутанол—уксусная кислота—вода (4 : 1 : 1).

Аналитическую ВЭЖХ проводили на хроматографе Shimadzu LC10 с использованием колонок Диасфер С-18, размером 4.0 х 250 мм и зернением 7 мкм ("ЗАО БиоХимМак СТ", Россия); объем петли инжектора — 10 мкл; детектировали при длине волны 254 нм. Элюирующая система содержала 0.01М раствор Н3РО4 (рН 2.6) и ацетонит-рил. Элюцию проводили в градиентном режиме при изменении концентрации ацетонитрила от 30 до 70% и скорости потока 1 мл/мин в течение 25 минут. Перед введением в колонку пробу разводили подвижной фазой.

UV-VIS-спектры выделенных антибиотиков снимали на спектрофотометре UV-1601 PC (Shimadzu, Япония).

Масс-спектры антибиотиков получали на приборе Ultraflex II MALDI TOF/TOF, "Bruker Dal-tonics", Германия, оснащенном УФ лазером (355 нм, Nd) в режиме образования положительных ионов с использованием рефлектрона; точность измерения масс составляла 0.001%. Для анализа на мишени смешивали по 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2.5-дигидроксибен-зойной кислоты (10 мг/мл) в 20% ацетонитриле (в воде) с 0.5% трифторуксусной кислотой и полученную смесь высушивали на воздухе.

ИК-спектры регистрировали с использованием ИК-Фурье-спектрометра "Nicolet-iS10" (детектор DTGS, светоделитель KBr) с приставкой "Smart Performer" (оснащение ZnSe-кристал-лом). Изме

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком