научная статья по теме АНТИМИКРОБНАЯ И ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИМИКРОБНАЯ И ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ ТРИПТОФАНА»

CLINICAL AND IMMUNOLOGICAL EFFICIENCY OF INTERMITTENT ALTITUDE CHAMBER HYPOXIA IN THE TIME OF CURING THE CHILDHOOD ATOPIC DERMATITIS AT THE STAGE OF REHABILITATION

Alemanova G. D., Popova L. Y., Anisimova T. M., Ayzhanova L. A., Hotian D. S., Volyanik O. V., Amanturlieva M. E.

Orenburg State Medical Academy Ministry of Health, Orenburg, Russia

One of the drug-free methods of curing of Childhood Atopic Dermatitis (CAD) at the stage of rehabilitation is intermittent altitude chamber hypoxia (IACH). The use of IACH while the complex therapy of CAD provided the lowering of symptom load at about 75% of patients. Positive immunological dynamics (lowering of level of IL-4 and of general IgE, and, by contrast, rise of concentration of IL-10) evidently is in account with longtime mobilizing effect of hypoxia accommodation. The findings allow to prove the practicability of IACH use for curing this category of patients.

Key words: аtopic dermatitis, intermittent altitude chamber hypoxi, cytokine, IgЕ

АНТИМИКРОБНАЯ И ГЕМОЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТИ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДОВ С ВЫСОКИМ СОДЕРЖАНИЕМ

ТРИПТОФАНА

Артамонов А.Ю.1, Орлов Д.С.1,2, Рыбакина Е.Г.1, Колодкин Н.И.3,

Смирнова М. П.3

ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН; 2ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный университет»; 3ФГУП «Гос. НИИ особо чистых биопрепаратов» ФМБА России, Санкт-Петербург, Россия

Актуальность представленного исследования определена проблемой устойчивости патогенных микроорганизмов к широко используемым типам противобактериальных лекарственных средств. Антимикробные пептиды человека, животных и растений являются молекулярным базисом их защиты от патогенных микроорганизмов. На основе природного триптофан-богатого пептида индолицидина создаются структурные аналоги, которые служат прототипами для разработки современных лекарственных препаратов. Всестороннее изучение обогащенных триптофаном пептидов является перспективным направлением иммунологии и медицины. В результате исследования биологической активности антимикробных пептидов индолицидина, тритриптицина, 3В3, GSP-1a и РигА нами установлено, что пептиды 3В3 и GSP-1 являются наиболее перспективными для дальнейшего изучения с целью создания на их основе лекарственных препаратов. Эти пептиды не вызывают лизис эритроцитов человека, но проявляют антибиотическое действие в отношении всех использованных в работе штаммов микроорганизмов.

Ключевые слова: врожденный иммунитет, природные антимикробные пептиды, резистентность микроорганизмов, гемолиз

Решение на глобальном международном уровне проблемы устойчивости патогенных микроорганизмов к широко используемым типам противобактериальных лекарственных средств, согласно данным ВОЗ, представленным в докладе «Antimicrobial resistance: global

report on surveillance 2014» [1], определяет актуальность выполненного исследования.

Антимикробные пептиды (АМП) - группа природных биологически активных веществ, которые продуцируются преимущественно нейтрофильными гранулоцитами и макрофа-

гами, а также клетками барьерных эпители-ев [2]. АМП обнаружены и у растений - в листьях, стеблях, цветках, корнях, корнеплодах и семенах [3]. Антимикробные пептиды животных и человека - молекулярная основа системы врожденного иммунитета. АМП растений выполняют защитную функцию от бактерий и грибов.

Большинство изученных антимикробных пептидов имеют общий положительный заряд, то есть являются катионными молекулами [4]. АМП животных и растений обладают уникальным свойством: они проявляют селективную активность в отношении бактерий по сравнению с их активностью в отношении эукариотических клеток. Важнейшим звеном реализации антимикробного действия АМП является контакт пептида с биологической мембраной. Взаимодействие между пептидом и клеткой-мишенью имеет электростатическую природу, поскольку пептид обладает общим положительным зарядом, а компоненты внешней мембраны бактерии, например, фосфатные группы липополисахаридов гра-мотрицательных бактерий или липотейхое-вые кислоты грамположительных микробов, заряжены отрицательно. Кроме того, преобладание отрицательно заряженных липидов в составе бактериальной цитоплазматической мембраны обусловливают избирательное действие АМП. Эукариотические клетки, напротив, несут преимущественно нейтральный заряд на своей поверхности.

Выработка у бактерий резистентности к антимикробным пептидам затруднена в связи с особенностями механизма их бактерицидного действия - быстрого, в течение минут, повышения проницаемости мембран микроорганизма, утратой их барьерной функции, приводящей к осмотическому разрушению клеток [5].

В настоящее время пептиды системы врожденного иммунитета рассматриваются как наиболее перспективная основа для создания препаратов с антибактериальными, фунги-цидными, противоопухолевыми и иммуно-корригирующими свойствами [6, 7, 8].

Представленная работа посвящена изучению одного из классов антимикробных пептидов - соединений с высоким содержанием в составе их молекул аминокислоты триптофан. Одним из наиболее полно изученных катионных природных пептидов этого класса

является выделенный из лейкоцитов быка ин-долицидин (Ind). Синтетические структурные варианты индолицидина служат основой для создания современных лекарственных препаратов [9]. Поэтому всестороннее изучение обогащенных триптофаном (W) пептидов является актуальной задачей иммунологии и биомедицины.

Цель работы. Исследование антимикробной и гемолитической активности природных триптофан-богатых пептидов животных и растений: Ind, тритриптицина, 3B3, GSP-1a и PurA.

Материал и методы. В работе использованы микроорганизмы Escherichia coli, штамм ML-35p; Listeria monocytogenes, штамм EGD; устойчивый к метициллину Staphylococcus aureus, штамм MRSA ATCC 33591; Candida albicans, штамм 820, которые были предоставлены проф. Р. Лерером (Калифорнийский университет, Лос-Анжелес, США). Для культивирования бактерий использовали среду на основе триптического гидролизата сои (TSB), грибков - среду Сабуро. В данной работе проведен анализ биологической активности природных пептидов: Ind (ILPWKWPWWPWRR-NH2), тритриптицина (VRRFPWWWPFLRR-NH2), 3B3 (PITWPWKWWKGG-NH2), GSP-1a (PLSWFFPRTWGKR-NH2), PurA (FPVTWRW WKWWKG-NH2). У индолицидина 5 аминокислотных остатков из 13 представлены триптофаном, что составляет 38%. Природный пептид из костного мозга свиньи тритрипти-цин состоит на 23% из триптофана. У природного пептида 3B3, выделенного из семян овса, доля триптофана составляет 33%. Пептиды эндосперма мягкой пшеницы пуроиндолин А (PurA) и grainsoftness protein a (GSP-1a) содержат 38% и 15% триптофана в структуре, соответственно. Перечисленные пептиды получены с помощью твердофазного химического синтеза на основе структур природных пептидов.

Определение минимальной ингибирующей концентрации (МИК) пептидов проводили с использованием ресазурина - хромогенного маркера метаболической активности клеток, и, как это описано ранее [10], методом радиальной диффузии в геле. При применении ре-сазурина пробы инкубировали при 37°С в течение 2 ч, одновременно на спектрофотометре проводили измерение их оптической плотности при длинах волн 570 и 600 нм.

Влияние пептидов на проницаемость внешней и внутренней мембран E. coli ML35p оценивали с помощью хромогенных и флуоресцентных маркеров проницаемости [11] - субстратов для фермента лактамазы в периплазматиче-ском пространстве и галактозидазы в цитоплазме микроорганизма. В качестве маркеров увеличения проницаемости внешней мембраны применяли Nitrocefin (Calbiochem-Nova-biochem, USA) или CCF2-свободную кислоту (Aurora Bioscience, USA), внутренней - ONPG (Sigma) или DiFMUG (Invitrogen, USA). Оценку изменения проницаемости мембран проводили в режиме реального времени в течение 60 минут.

Фотометрический метод оценки гемолитической активности антимикробных пептидов в отношении эритроцитов человека основан на измерении оптической плотности проб, содержащих гемоглобин, вышедший из лизированных эритроцитов, при длине волны 540 нм. Эритроциты человека получали от здоровых доноров 20-30 лет с применением стандартной методики. Клетки инкубировали с пептидами при 37°C в течение 30 мин.

Результаты. Пептиды тритриптицин, 3B3, GSP-1a и PurA, так же как и индолицидин, являются высокоактивными антимикробными веществами в отношении ряда микроорганизмов. В табл. приведены результаты определения минимальной ингибирующей рост микроорганизмов концентрации пептидов (МИК).

Пептиды тритриптицин, PurA, GSP-1a, 3B3 и индолицидин вызывают увеличение проницаемости внешней мембраны E. coli ML-35p. Помимо высокой антимикробной активности, установлено избирательное действие пептидов GSP-1a и 3B3 на проницаемость внутренней

мембраны E. coli ML-35p, а также отсутствие их гемолитического эффекта, в отличие от PurA, индолицидина и тритриптицина, которые вызывают увеличение проницаемости цитоплаз-матической мембраны E. coli, а также, в используемом диапазоне концентраций, и лизис 8, 30 и 45% эритроцитов, соответственно.

В результате исследования установлено, что пептиды 3B3, GSP-1, которые до настоящего времени оставались малоизученными, являются перспективными молекулами для дальнейшего анализа с целью создания на их основе лекарственных препаратов - антибиотиков нового поколения. Эти пептиды не вызывают лизис эритроцитов человека, но проявляют антибиотическое действие в отношении всех использованных в работе микроорганизмов.

Работа выполнялась при поддержке гранта РФФИ (проект № 13-04-02102а).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ISBN: 978 92 4 156474 8 [Electronic resource] World Health Organization [Official site]. URL http://www.who.int/drugresistance/documents/ surveillancereport/en/

2. Yeung A. T., Gellatly S. L., Hancock R. E. Cell. Mol. Life Sci. 2011, 68 (13),. 2161-2176.

3. Nawrot R., Barylski J., Nowicki G., Broniarczyk J., Buchwald W. et al. Folia Microbiol (Praha) 2014, 59,181-196.

4. Wang Z., Wang G. Nucleic Acids Res. 2004, 32, 11, D590- D592.

5. Orlov D. S., Nguyen T., Lehrer R. I. J. Microbiol. Methods 2002, 49 (3), 325-328.

6. Шамова О. В., Сакута Г.А, Орлов Д. С., Зен

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»