ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2012, том 446, № 5, с. 580-582
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 591.151.4:612.014.481/.482
АНТИМУТАГЕНЫ ф-ПУРОТИОНИН И КРАУН-СОЕДИНЕНИЕ) КАК МОДУЛЯТОРЫ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОЦЕССАХ ОНКОГЕНЕЗА, В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА
© 2012 г. Г. Д. Засухина, Т. И. Одинцова, Л. В. Шуленина, Л. Н. Ушенкова, В. Ф. Михайлов, Ж. М. Шагирова, А. Н. Ведерников, С. П. Громов, академик М. В. Алфимов
Поступило 13.04.2012 г.
Уровень экспрессии гена отражает количество синтезируемого продукта. У большинства генов экспрессия может меняться при различных условиях. Одним из таких модуляторов могут служить лекарственные препараты, применяемые, например, для лечения опухолей. Вместе с тем эффект модулятора зависит от особенностей генотипа. Так, химиотерапевтические препараты повышали экспрессию гена MVP у носителей мутантного ТТ-генотипа ABCCIrs35605, а у носителей мутантного генотипа TP53rs1042522 экспрессия гена MVP снижалась [1].
В качестве модуляторов экспрессии генов в данной работе были выбраны препараты, антимутагенная активность которых была обнаружена нами ранее. Антимутагены — вещества, которые ослабляют повреждающее действие мутагенов физической (радиация) и химической природы. Большая часть антимутагенов обладают также антиканцерогенными свойствами, которые часто коррелируют с антиоксидантной активностью, при этом они могут быть адаптогенами, радиопротекторами, а также геропротекторами.
К настоящему времени испытано огромное число растительных препаратов, главным образом экстрактов растений и их компонентов, витаминов, которые благодаря многовекторности своего действия оказались эффективными антимутагенами в отношении радиации и многих химических мутагенов, а также обладали защитным действием, повышая противоопухолевую реактивность [2, 3]. Например, описан противоопухолевый эффект экстракта омелы белой и его основное действующее вещество — лектин: обнару-
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской Академии наук, Москва Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна, Москва Центр фотохимии Российской Академии наук, Москва
жено подавление пролиферации опухолевых клеток in vitro, сочетающееся с индукцией апо-птоза [4]. Механизмы цитостатического действия этого препарата связаны с ингибированием синтеза белка в результате инактивации рибосом, с активацией каскада каспаз и изменением содержания активных форм кислорода. На уровне организма обнаружены иммуномодулирующие эффекты (повышение активности NK-клеток, возрастание уровня цитокинов и т.п.). В опытах на животных с опухолями, которым вводили этот экстракт, было показано снижение числа метастазов и достоверное продление жизни. Нельзя не упомянуть об обнаруженной способности омелы белой усиливать синтез Р-эндорфина (нейроме-диатора "удовольствия") у больных раком молочной железы, получавшим инъекции этого препарата, что, естественно, коррелирует с улучшением качества жизни.
Нами была показана антимутагенная активность экстрактов алоэ, пшеницы, зеленого чая в отношении хлорида кадмия в клетках человека. Более того, нами были обнаружены антимутагенные свойства антимикробного пептида — 0-пуро-тионина, выделенного из устойчивого к стрессовым воздействиям сорта пшеницы T. kiharae [5]. Этот положительно заряженный полипептид состоит из 45 аминокислотных остатков и обладает выраженными антимутагенными свойствами в клетках человека при воздействии хлорида кадмия. Если коэффициент защиты при воздействии хлорида кадмия в опытах с использованием в оптимальной концентрации экстракта алоэ составлял 69%, зеленого чая — 46%, проростков пшеницы — 73%, то этот показатель в клетках человека, обработанных Р-пуротионином, достигал 85—88%.
Известны также синтетические антимутагены, снижающие повреждающее действие радиации и химических мутагенов. Нами был испытан один из наиболее эффективных препаратов из ряда краун-соединений — бензодиаза-15-краун-5 (химическая формула C18H26N2O7). Было показано,
АНТИМУТАГЕНЫ (ß-ПУРОТИОНИН И КРАУН-СОЕДИНЕНИЕ)
581
ARF
p53
NPM1
Ч о о 8
g 7
6
Я
я
о о
<D
Л
я 4
0 ^
s3
1 2 |i
0
о Медиана эффективности
525-75%
доверительный интервал
_1_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I_I
| £ §
О й Й
Л Ol Ä ££ g
н о
й с
| £ §
О й Й
Л ^ Ä ££ g
н о
£ с
| £ § о Й й
Л ^ Ä ££ g
н о
£ с
400 г
350 -
<D
Я
н о 300 -
я~ 250 -
к
о
о р 200 -
Я
о 150 -
л
я (D 100-
«
о р 50-
У
Медиана эффективности 25-75% | доверительный » интервал
Л Ч О
я о
£
сЗ
р
К
Я
я я
о ^
о й С
0
Рис. 1. Уровень экспрессии генов-супрессоров опухолевого роста ARF, р53, КРМ1 в лимфоцитах крови человека, обработанных краун-соединением и р-пуро-тионином.
Рис. 2. Уровень экспрессии гена-активатора опухолевого роста с-Мус в лимфоцитах крови человека, обработанных краун-соединением и р-пуротионином.
что этот препарат обладал антимутагенной активностью в клетках здоровых людей и пациентов с синдромом Дауна, характеризующихся повышенной чувствительностью к радиации и некоторым химическим мутагенам, при воздействии хлорида кадмия [6]. При этом не было обнаружено различий в защитных свойствах этого вещества как в клетках здоровых доноров, так и в клетках пациентов с синдромом Дауна в зависимости от особенностей полиморфизма исследованных нами генов (детоксикации, репарации, онкогене-за и др.): коэффициент защиты достигал 40% и более. Целью исследования было изучение модулирующего влияния антимутагенов — р-пуротио-нина и краун-соединения — на экспрессию ряда генов в клетках человека, которые могут детерминировать процесс превращения нормальной клетки в опухолевую.
В качестве исследуемых генов, экспрессия которых отражает уровень их активности, были выбраны гены-супрессоры опухолевого роста (р53, КРМ, АРБ) и протоонкогены (к-Яа8, с-Мус), являющиеся компонентами ряда путей передачи сигнала, а также принимающие участие в регуляции транскрипции, клеточного цикла, пролиферации, дифференциации, факторов роста. Кроме того, эти гены являются регуляторами трансляции белков, поддержания генетической стабильности в клеточных процессах превращения нормальной клетки в опухолевую [7, 8]. Стрессовые воздействия активируют экспрессию генов АЯБ и КРМ, которые, взаимодействуя с другими генами, передают сигнал гену р53. Мутации в гене р53
обнаруживаются примерно в 50% опухолей человека. Мутантные варианты исследуемых генов обнаруживаются в разных процентных соотношениях в зависимости от вида и структуры опухолей.
Один из наиболее распространенных и точных методов оценки экспрессии генов — определение ее на транскрипционном уровне, т.е. по уровню мРНК [9]. Уровень экспрессии генов p53, K-ras, NPM1, с-Мус и ARF определяли в лимфоцитах крови человека после их стимуляции ФГА и инкубации (24 ч) с синтетическим антимутагеном бен-зодиаза-15 -краун- 5 -соединением (с химической формулой C18H26N2O7, синтезированным в Центре фотохимии РАН) в концентрации 10 мМ/мл и ß-пуротионином Tk-АМР-ВР, в концентрации 10 мкг/мл. Выделение тотальной РНК из лимфоцитов проводили тризольным методом с использованием набора "Trizol RNA Prep 100" (ООО "Лаборатория Изоген") в соответствии с протоколом фирмы-производителя. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием набора "GenePak RT-PCR Соге" (ООО "Лаборатория Изоген"), содержащего обратную транскриптазу MMLV и случайные гексануклеотидные праймеры. Полученные образцы комплементарной ДНК (кДНК) использовали в качестве матрицы для проведения двухстадийной ПЦР в реальном времени.
Экспрессию генов p53 и K-ras определяли методом ПЦР в режиме реального времени с применением интеркалирующего красителя SYBR Green I, применяли набор "Maxima SYBR Green/ROX qPCR
582
ЗАСУХИНА и др.
Э я
н о
я
и
о о
(D р
я
о
о л
и
о «
о £
2.4 2.2 2.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6
о Медиана эффективности
525-75%
доверительный интервал
Л §
р
Н
И о ¡4
сЗ р
И
и
Я
о ^
о й ti
Рис. 3. Уровень экспрессии гена-активатора опухолевого роста k-Ras в лимфоцитах крови человека, обработанных краун-соединением и ß-пуротионином.
Master Mix (2X)" ("Fermentas") согласно прилагаемому протоколу [10, 11]. Экспрессию генов NPM1, с-Mye определяли с использованием линейных зондов (TaqMan технология) [12—14]. ARF и референтный GAPDH определяли методом мультиплексной ПЦР, как описано в работе [15].
Измерения проводили на Реал-тайм-ампли-фикаторе iCycler c оптическим блоком iQ5 (фирмы "Bio-Rad").
Окончательный расчет уровня экспрессии исследуемых генов до и после оказанного воздействия, нормализованного по интенсивности сигнала GAPDH, проводили по формулам [14].
Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью пакета статистических программ STATISTICA 7, она включала в себя определение медианы и интерквартильного размаха. Для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Манна-Уитни.
Из данных рис. 1 видно, что уровень экспрессии гена ARF не изменялся в клетках, обработанных и ß-пуротионином, и краун-соединением. Краун-соединение увеличивало активность гена-супрессора р53 в 1.7 раза (p < 0.01), тогда как ß-пу-ротионин не влиял на этот показатель. Экспрессия гена NPM1 находилась в пределах контрольных показателей.
Что касается протоонкогенов, то на рис. 2 показано достоверное снижение экспрессии гена c-Myc и в опытах с ß-пуротионином, и с краун-соединением (в 1.8 раза,p < 0.05). При этом ß-пу-ротионин снижал уровень экспрессии в большей степени.
Экспрессия гена-активатора опухолевого роста k-Ras снижалась при обработке клеток ß-пу-
ротионином (в 1.32 раза, p < 0.01) и повышалась в опытах с краун-соединением по сравнению с контрольными показателями (в 1.33 раза, p < 0.01) (рис. 3). Следовательно, исследуемые антимутагены оказывали влияние на экспрессию генов, принимающих участие в превращении нормальной клетки в злокачественную. Можно полагать, что ß-пуротионин, который подавляет уровень экспрессии c-Myc- и k-Ras-генов, является перспективным для изучения как препарат, снижающий активность протоонкогенов. Краун-соеди-нение — антимутаген, является модулятором актив
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.