НЕЙРОХИМИЯ, 2014, том 31, № 4, с. 321-327
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.121.7-612.82
АНТИОКИСЛИТЕЛЬНАЯ ЗАЩИТА В КОРЕ МОЗГА, МОЗЖЕЧКЕ, ГИППОКАМПЕ И СТРИАТУМЕ КРЫСЫ И ЕЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ПОРТОКАВАЛЬНОМ ШУНТИРОВАНИИ © 2014 г. Ю. Г. Каминский, Е. Е. Белоушко, Е. А. Косенко*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино
Портокавальные анастомозы спонтанно возникают при печеночной недостаточности и ведут к хронической гипераммониемии и гепатоэнцефалопатии. Аммиак вызывает окислительный стресс в мозге. В данной работе проведено сравнительное исследование состояния антиокислительной системы в разных отделах мозга крысы и влияния на него портокавального шунтирования. Через четыре недели после хирургической операции определяли активность каталазы, Си,/п-супероксид-дисмутазы, глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатионтрансферазы в цитоплазме и содержание окисленных белков в митохондриях неокортекса, мозжечка, гиппокампа и стриатума. Все четыре отдела мозга отличались один от другого по содержанию аммиака и активности каждого фермента-антиоксиданта. Только в мозжечке и стриатуме животных с портокавальным шунтом активность глутатионтрансферазы снижена по сравнению с контролем. После портокавального шунтирования активность каталазы, Си,/п-супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы ни в одном отделе мозга не отличалась от контрольных значений. Обратная корреляция между содержанием окисленных белков и активностью глутатионтрансферазы позволяет предполагать, что в патогенезе гепатоэнцефалопатии может играть роль сниженная активность глутатион-трансферазы в мозжечке и стриатуме, но не другие антиокислительные ферменты и отделы мозга.
Ключевые слова: портокавальное шунтирование, ферменты-антиоксиданты, неокортекс, мозжечок, гиппокамп, стриатум.
DOI: 10.7868/S1027813314030066
ВВЕДЕНИЕ
Портокавальное шунтирование (ПКШ) является хирургическим способом создания искусственного канала между воротной и полой венами печени для оттока венозной крови в системный кровоток в обход печени. Многие болезни человека (цирроз, гепатиты, алкоголизм) вызывают гипер-тензию в воротной вене и внутреннее кровоизлияние, зачастую ведущие к гибели пациентов. В таких случаях хирургическое ПКШ необходимо для гемо-динамической коррекции портальной гипертензии, остановки гастроэзофагеального кровотечения и сохранения жизни больного. С другой стороны, портокавальные анастомозы, спонтанно возникающие при печеночной недостаточности, ухудшают детоксикацию аммиака и ведут к хронической ги-пераммониемии и гепатоэнцефалопатии — главной причине смерти при этом заболевании.
Механизмы нарушения функций мозга при гипераммониемии изучены недостаточно. Иссле-
* Адресат для корреспонденции: 142290, Пущино, ул. Институтская, д. 3; тел.: (496) 773-91-68; e-mail: gieraki@mail.ru. Список сокращений: ГП — глутатионпероксидаза; ГР глута-тионредуктаза; ГТ — глутатионтрансфераза; ПКШ — портокавальное шунтирование; СОД — супероксиддисмутаза.
дования на моделях животных с острой печеночной недостаточностью [1, 2] показали, что аммиак вызывает окислительный стресс в мозге. Однако результаты анализа окислительного стресса при гепатоэнцефалопатии у пациентов или в экспериментах на животных немногочисленны и противоречивы [3], а данные по ферментам-анти-оксидантам в отделах мозга и субклеточных фракциях фрагментарны или полностью отсутствуют в литературе. В данной работе проведено сравнительное исследование состояния антиокислительной системы в разных отделах мозга крысы и влияния на него ПКШ. Определялась активность Си^п-супероксиддисмутазы (СОД), каталазы, глутатионпероксидазы (ГП), глутатионредуктазы (ГР) и глутатионтрансферазы (ГТ) в цитозоле, а также содержание окисленных белков в митохондриях неокортекса, мозжечка, гиппокампа и стриатума в норме и через четыре недели после операции ПКШ.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные процедуры выполнены в соответствии с Европейскими правилами по использованию лабораторных животных 1986 г.
322
KAMИHСKИЙ и др.
(Правила лабораторной практики в РФ. Приказ Министерства здравоохранения РФ от 19.06.2003 № 267).
В экспериментах использовали самцов крыс Вистар массой 250—300 г. Животные были разделены на две группы: для операции ПКШ (n = 6) и контрольные для ложной операции (n = 8). Операцию проводили под общим наркозом. ПКШ конец-в-бок выполняли методом Ли и Фишера [4]. Поскольку после операции масса тела у животных постепенно уменьшается (в связи с потреблением уменьшенных количеств корма), исследования проводили через четыре недели, когда животные обеих групп отличались незначительно по массе тела [5].
В основном использовали реактивы фирмы "Sigma Chemical Co." (St. Louis, USA).
Все препаративные процедуры выполняли при 2—4°C.
Животных декапитировали, мозг быстро удаляли и отделяли неокортекс, мозжечок, гиппо-камп и стриатум.
Митохондрии выделяли из каждого отдела мозга методом, описанным ранее [6]. Постмито-хондриальный супернатант центрифугировали при 100000 g и полученный супернатант использовали как цитоплазматическую фракцию. В цитоплазме определяли активность каталазы, C^Zn-СОД, ГП, ГТ и ГР.
Одним из маркеров окислительного стресса является карбонилирование белков. В мозге крысы митохондрии представляют собой главный клеточный источник как перекиси водорода, так и белковых карбонильных групп [7]. Поэтому оценивался окислительный стресс в отделах мозга по увеличению общего количества окисленных белков в митохондриях.
Активность СОД (КФ 1.15.1.1), каталазы (КФ 1.11.1.6), ГП (КФ 1.11.1.9) и ГР (КФ 1.8.1.7) определяли методами, описанными ранее [8, 9]. За единицу активности СОД принято количество белка, при котором скорость восстановления п-нитротетразолия синего в ксантин-ксантинокси-дазной системе снижается в 2 раза.
Активность ГТ (КФ 2.5.1.18) измеряли методом Козера и др. [10] с модификациями. В 1 мл 100 мМ фосфатного буфера, pH 7, содержащего 1 мМ ЭГТА, 1 мМ глутатион, 1 мМ хлординитро-бензол, добавляли 100 мкг белка цитозоля. Реакцию регистрировали спектрофотометрически при 340 нм и 37°C, и при расчетах применяли коэффициент поглощения 9.6 мМ-1 см-1.
**Операция выполнялась в Лаборатории нейрологии в Валенсии, Испания (Centre de Investigaciones Principe Felipe, Valencia, 46012 Spain). Авторы выражают благодарность Ana Agusti и Vicente Felipo за техническую помощь.
Содержание карбонилированных белков определяли методом Ahn et al. [11]. Для этого отбирали две равные части митохондрий по 400 мкг белка в каждой. Обе части инкубировали в 1%-ном растворе стрептомицинсульфата в течение 15 мин при 4°C для удаления нуклеиновых кислот, затем пробы центрифугировали при 14000 g в течение 10 мин при 4°C. Один супернатант обрабатывали 10 мМ динитрофенилгидрази-ном (ДНФГ) в 2N HCl (в соотношении 1 : 2), а другой — равным объемом 2N HCl. Оба образца инкубировали 45 мин при 4°C в пробирках Эп-пендорфа в темноте при постоянном перемешивании в шейкере. Затем белок осаждали равным объемом 20%-ной трихлоруксусной кислоты и после центрифугирования собирали и трижды промывали смесью этанол-этилацетат (1 : 1) при
14 000 g в течение 10 мин при 4°C. Конечный осадок подсушивали, растворяли в 0.5 мл 6 M гуани-дингидрохлорида с 20 мМ фосфатным буфером (pH 2.5) и инкубировали при 37°C в течение
15 мин в шейкере при постоянном перемешивании. Содержание окисленных (содержащих карбонильные группы) белков определяли по разности светопоглощения между ДНФГ-обработанным образцом и HCl-обработанным контролем при 370 нм. Результат вычисляли с применением коэффициента поглощения гидразона 22 мМ-1 см-1 и выражали в нмолях ДНФГ на 1 мг белка. Поскольку на разных стадиях промывания терялось до 15% белка, концентрацию белка измеряли в осадке, растворенном в 6 M гуанидингидрохло-риде, по поглощению при 260-280 нм. Количество белка вычисляли по стандартной кривой для бычьего сывороточного альбумина, растворенного в 6 M гуанидингидрохлориде.
Содержание аммиака в плазме крови, неокор-тексе и стриатуме определяли микрофлуориметри-чески [12]. Данные по аммиаку в плазме, мозжечке и гиппокампе взяты из предыдущей статьи [13].
Концентрацию аммиака в цитоплазме мозга рассчитывали исходя из условия, что в 1 г ткани имеется приблизительно 0.5 мл цитоплазматиче-ской воды [14].
Статистический анализ выполняли с помощью компьютерной программы Prizm 5.00 (GraphPad, San Diego, USA). Результаты выражали в виде среднего значения и стандартной ошибки. Нормальность распределения переменных подтвердили с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Парные сравнения проводили по статистике Стьюдента, а различия между тканями анализировали методом ANOVA с использованием i-критерия для множественных сравнений и поправки Бонферрони.
0.6 г
Неокортекс Гиппокамп Мозжечок Стриатум
Рис. 1. Содержание аммиака в мозжечке, гиппокам-пе, неокортексе и стриатуме контрольных животных. Результаты приведены как М ± 8Е. *р < 0.05, **р < 0.01 при сравнении с мозжечком (¿-тест с поправкой Бон-феррони).
Неокортекс Гиппокамп Мозжечок Стриатум
Рис. 2. Активность каталазы в неокортексе, гиппо-кампе, мозжечке и стриатуме контрольных животных. Результаты приведены как М ± 8Е. ***р < 0.001 при сравнении с мозжечком (Г-тест с поправкой Бон-феррони).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Концентрация аммиака в плазме крови составляла 0.14 ± 0.02 мМ у крыс контрольной группы (ложно-оперированных). Она достоверно увеличивалась в 2 раза в группе крыс с портокаваль-ным анастомозом (до 0.27 ± 0.02 мМ, р = 0.0002).
В четырех отделах мозга контрольных крыс содержание аммиака неодинаково (рис. 1). Оно максимально в мозжечке, много ниже в других отделах мозга и минимально в неокортексе. Отличия между мозжечком и каждым другим отделом мозга достоверны.
У животных с портокавальным шунтом концентрация аммиака во всех отделах мозга выше, чем у контрольных крыс, но это превышение неодинаково: на 40, 99, 39 и 47% в мозжечке, неокортексе, гиппокампе и стриатуме соответственно (табл. 1). В пересчете на цитоплазматиче-скую воду [14] концентрация аммиака в цитозоле мозжечка достига
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.