БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2011, том 28, № 4, с. 274-283
УДК 581.1:581.19
АНТИОКСИДАНТНАЯ ФУНКЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ОКСИДАЗЫ В МИТОХОНДРИЯХ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ ПРИ ХОЛОДОВОМ ЗАКАЛИВАНИИ
© 2011 г. О. И. Грабельных, Т. П. Побежимова, Н. С. Павловская, Н. А. Королева, О. А. Боровик*, И. В. Любушкина, В. К. Войников
Учреждение Российской академии наук Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения РАН, 664033, Иркутск, а/я 317; электронная почта:grolga@sifibr.irk.ru *ГОУВПО Иркутский государственный университет, 664003, Иркутск, ул. Сухэ-Батора, 5
Поступила в редакцию 01.02.2011 г.
Изучена активность альтернативной оксидазы (АО) и образование активных форм кислорода (АФК) в митохондриях озимой пшеницы ТпНеит aestivum Ь., выделенных из проростков, подвергнутых одной (7 сут при 2—3°С) и двум (7 сут при 2—3°С и 2 сут при —2°С) фазам холодового закаливания. С использованием ингибиторов дыхательной цепи установлена антиоксидантная роль АО в первой фазе холодового закаливания. Показано, что действие низкой положительной температуры приводит к подавлению цитохромного пути транспорта электронов в митохондриях, повышению содержания АФК и переключению транспорта электронов с цитохромного на альтернативный путь. Обнаружено, что сукцинат и антимицин А снижают образование АФК в митохондриях проростков во время прохождения двух фаз холодового закаливания. По-видимому, в этих условиях могут функционировать разобщающие белки. Таким образом, антиоксидантную функцию АО в первую фазу холодового закаливания можно рассматривать как важную составляющую механизма низкотемпературной адаптации озимых злаков. Предполагается, что в качестве сигнальных молекул, регулирующих активность двух энергорассеивающих систем (АО и разобщающих белков), в митохондриях озимых злаков при холодовом закаливании могут выступать АФК и свободные жирные кислоты.
Ключевые слова: альтернативная оксидаза, альтернативный путь, цитохромный путь, активные формы кислорода, митохондрии, холодовое закаливание, озимая пшеница.
Электрон-транспортная цепь (ЭТЦ) митохондрий является одним из источников образования АФК в растительных клетках, особенно нефото-синтезирующих [1, 2]. У растений ЭТЦ состоит из двух частично перекрывающихся дыхательных путей: цитохромного, с цитохромоксидазой в качестве терминальной оксидазы, и альтернативного, терминальной оксидазой в котором служит альтернативная оксидаза (АО) [3—5]. Эти дыхательные пути расходятся на уровне пула убихи-нон/убихинол, причем альтернативный путь транспорта электронов более короткий, поскольку АО окисляет непосредственно убихинол и использует электроны для восстановления кислорода до воды. АО не обладает способностью к переносу протонов, энергия потока электронов через АО высвобождается в виде тепла. Единственная строго доказанная функция альтернативного пути — использование образующегося тепла при опылении некоторых растений, в частности растений семейства ароидных [6]. Одна из возможных функций АО — использование электронов для предотвращения высокого уровня восстанов-ленности убихинонового пула ЭТЦ митохон-
дрий, которое может привести к образованию АФК [7—12]. Местом образования АФК в дыхательной цепи являются комплексы I и III [1], в которых генерируется супероксидный радикал, значительное увеличение уровня которого может приводить к накоплению перекиси водорода [12]. В нормальных условиях содержание АФК в митохондриях поддерживается на низком уровне благодаря антиоксидантным системам, призванным постоянно удалять АФК [1, 2, 10]. Однако в условиях стресса содержание АФК в клетках начинает увеличиваться, и развивается окислительный стресс. Предотвращение образования АФК при помощи АО является первой линией защиты митохондрий от окислительного стресса [13]. Сходную функцию в митохондриях растений могут выполнять разобщающие белки [14—16]. В связи с этим особенно важную роль при стрессе может играть антиоксидантная активность АО и разобщающих белков. Митохондриальная регуляция экспрессии ядерных генов, обозначенная как "ретроградная регуляция", у растений еще мало изучена [17]. АФК могут участвовать в индукции экспрессии генов АО [18, 19]. Предполагается,
что в растениях, подвергнутых стрессовым воздействиям, сигнал передается из митохондрий в ядро, а опосредованная митохондриальным сигнальным путем индукция ядерных генов, включая гены АО, позволяет поддерживать клеточный гомеостаз в изменившихся условиях [20]. Однако до сих пор не установлено, вовлечены ли АФК в индукцию генов АО как посредники специфического сигнального пути или же вызывают повреждение клетки и различные нарушения клеточного метаболизма.
Холодовое закаливание придает озимым культурам способность переносить воздействие неблагоприятных низких температур [21]. На различных растительных объектах показано, что АО может играть критическую роль при холодовом закаливании. Существуют данные, согласно которым под действием низких положительных температур повышается уровень транскриптов АО [22—25], содержание белка [26—28], а также способность к транспорту электронов по альтернативному пути [25, 29—33]. Однако ответ альтернативного пути на холодовое воздействие выяснен не до конца, но установлена его вариабельность у различных видов растений. Так, ШЪа8-СагЪо и соавт. [31] обнаружили, что при воздействии холода активность АО возрастает только в листьях растений холодочувствительных линий кукурузы. В то же время показано, что усиление накопления транскриптов ЯАОХ1а и ЯАОХ1с озимой пшеницы и активности альтернативного пути при холодовом закаливании у холодоустойчивого сорта были выше, чем у холодочувствительного [25]. По-видимому, способность альтернативного пути отвечать на низкотемпературные условия у пшеницы является одним из факторов, определяющих различие сортов по холодо/морозоустой-чивости [24, 25]. Показано также, что увеличение активности АО при холодовом закаливании Ага-Ыйор$15 ЛаНапа носит временный характер и снижается, как только растения восстанавливают поток электронов через цитохромный путь [34].
Несмотря на большое количество работ, посвященных функционированию АО в условиях низких температур, вопрос о роли этого фермента в данных условиях остается дискуссионным. В связи с этим цель нашей работы состояла в изучении активности АО и ее антиоксидантной функции на разных этапах холодового закаливания проростков озимой пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Митохондрии выделяли из проростков озимой пшеницы (ТгШсыш агзИуыт Ь., сорт Иркутская озимая), полученных в обычных условиях и в условиях низкотемпературной обработки.
Проращивание семян пшеницы. Семена промывали мыльным раствором и замачивали в 0.01%
растворе KMnO4 в течение 20 мин. Затем семена тщательно отмывали и проращивали в течение 2.5 сут на влажной фильтровальной бумаге при 26°С. Для прохождения первой фазы закаливания кювету с проростками переносили в холодильную камеру с температурой +2...+3°С на 7 сут, а затем выдерживали в течение 2 сут в инкубаторе с температурой —2°С для прохождения второй фазы закаливания. Контрольные проростки выращивали в течение 3 сут при 26°С. Об эффективности холодового закаливания судили по синтезу дегид-ринов. Для этого использовали денатурирующий гель-электрофорез и вестерн-блотинг с антителами против дегидринов (предоставлены T. Close, США).
Митохондрии выделяли из побегов проростков при помощи дифференциального центрифугирования. Растительную ткань разрушали с помощью пресса, среда гомогенизации содержала 300 мМ сахарозу, 40 мМ MOPS-КОН (рН 7.4), 10 мМ KCl, 2 мМ EDTA, 1 мМ MgCl2, 0.5% цистеин и 0.2% бычий сывороточный альбумин (БСА). Митохондрии очищали в ступенчатом градиенте перколла (25 и 8 мл 23 и 35% (v/v) перколла) по ранее опубликованной методике [35] с небольшими изменениями. Суспензию промытых митохондрий (60—90 мг белка) ресуспендировали в 1— 1.5 мл среды, состоящей из 300 мМ сахарозы и 40 мМ MOPS-КОН (рН 7.4), наслаивали на градиент перколла и центрифугировали при 24 500 g в течение 45 мин. Фракция интактных митохондрий локализовалась в нижней части 23% перколла на границе с 35% перколлом. Митохондрии освобождали от перколла, разбавляя перколл в 20 раз средой ресуспендирования (v/v). Митохондрии осаждали из разбавленной суспензии при 24500 g в течение 10 мин. Осадок очищенных митохондрий повторно промывали 10 объемами среды ре-суспендирования и переосаждали в течение 5 мин при 24500 g. Суспензию митохондрий (~10—18 мг белка/мл) хранили на льду. Интактность внешней мембраны митохондрий рассчитывали по скорости аскорбат-зависимого стимулируемого цитохро-мом с KCN-чувствительного поглощения кислорода в отсутствие и присутствии 0.04% Тритона Х-100. Интактность внешней мембраны митохондрий, выделенных из контрольных проростков и проростков, прошедших холодовое закаливание, составляла 92—93%.
Скорость дыхания митохондрий определяли с использованием кислородного электрода Кларка и полярографа ОН-105 (Венгрия) при 26°С. Реакционная среда содержала 300 мМ сахарозу, 20 мМ MOPS (рН 7.4), 5 мМ МgСl2, 10 мМ EDTA и 0.1% БСА (свободный от жирных кислот). В качестве субстрата окисления использовали 8 мМ сукци-нат в присутствии 5 мМ глутамата. Сукцинатде-гидрогеназу активировали, добавляя 200 мкМ АТР, АО — 1 мМ пируват и 5 мМ дитиотреитол (ДТТ). Для ингибирования комплекса I ЭТЦ использовали
3 мкМ ротенон, комплекса III ЭТЦ — 20 мкМ анти-мицин А, цитохромоксидазы — 0.4 мМ KCN, АО — 1 мМ бензгидроксамовую кислоту (БГК). Максимальную скорость окисления сукцината измеряли в присутствии 1 мкМ СССР или 50—100 мкМ ADP. Концентрацию митохондриального белка определяли согласно [36].
Содержание АФК в изолированных митохондриях определяли с использованием нефлуорес-цирующего H2DCF-DA (2', 7'-дихлорфлуоресце-индиацетата), который переходит во флуоресцирующую форму (DCF — дихлорфлуоресцеин) при реакции с пероксидом водорода [9]. Суспензию митохондрий (0.1—0.2 мг белка) инкубировали в реакционной среде с необходимыми добавками, а затем добавляли H2DCF-DA в конечной концентрации 1 мкМ и инкубировали в течение 25 мин при 26°С. Затем образцы центрифуг
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.