ш
БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 2014, том 40, № 1, с. 85-91
УДК 547.563.4'599+547.422.52'422.52
АНТИОКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА КОНЪЮГАТОВ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ТЕРПЕНОФЕНОЛЬНЫЕ ФРАГМЕНТЫ
© 2014 г. И. Ю. Чукичева*, М. А. Торлопов*, Е. В. Буравлев*, #, О. Г. Шевченко**, А. В. Кучин*
*ФГБУНИнститут химии Коми научного центра Уральского отделения РАН, 167982, ГСП-2, Сыктывкар, ул. Первомайская, 48
**ФГБУНИнститут биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, Сыктывкар
Поступила в редакцию 18.06.2013 г. Принята к печати 25.06.2013 г.
Серия водорастворимых конъюгатов получена исходя из 4-бромометил-2,6-диизоборнилфенола и полиэтиленгликолей различной длины. Оценка мембранопротекторной и антиоксидантной активности синтезированных продуктов на модели Н2О2-индуцированного гемолиза эритроцитов показала, что конъюгаты обладают выраженной антиоксидантной активностью. Существенный мем-бранопротекторный эффект выявлен у конъюгатов с массовым содержанием 2,6-диизоборнил-4-метиленовых фрагментов 0.2 и 0.8 масс. %.
Ключевые слова: полиэтиленгликоли, терпенофенолы, антиоксиданты, мембранопротекторные свойства, эритроциты, окислительный гемолиз.
БОТ: 10.7868/80132342314010023
ВВЕДЕНИЕ
Перспективные соединения для создания современных лекарственных препаратов должны обладать не только высокой фармакологической активностью, но и хорошей растворимостью и стабильностью в физиологических жидкостях, пролонгированным действием, а также низким уровнем токсичности [1—3]. Для придания водо-растворимости гидрофобным органическим молекулам могут быть использованы методы их гидрофилизации с помощью высокомолекулярных соединений. Для этих целей успешно применяются полиэтиленгликоли (ПЭГ) различной молекулярной массы, а сама процедура получила название пегилирование [4, 5]. В последние десятилетия пегилирование широко применяется при создании новых лекарственных средств, поскольку существенно улучшает биофармацевтические характеристики препаратов, такие как биосовместимость, устойчивость к энзиматиче-ской деградации и время циркуляции в крови, увеличивает водорастворимость, снижает токсичность и почечный клиренс [6—10]. Конъюгаты
Сокращения: ПЭГ — полиэтиленгликоли, ПОЛ — перекис-ное окисление липидов; ТБК-АП — продукты, реагирующие с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты), охуНЬ — оксигемоглобин; теШЬ — метгемогло-бин; ¡епуЩЬ — феррилгемоглобин.
# Автор для связи (тел.: +7 (8212) 21-99-16; факс: +7 (8212) 2184-77; эл. почта: buravlev-ev@chemi.komisc.ru).
на основе полиэтиленгликолей способны проникать через плазматическую мембрану путем эндо-цитоза, переносить лекарственные средства внутрь клетки и высвобождать их в свободном виде [8, 10].
Длина цепи ПЭГ может влиять на взаимодействие соединений с компонентами крови [1]. Перспективным представляется создание препаратов путем конъюгации с полиэтиленгликолями, отличающимися большой молекулярной массой, поскольку у этих соединений существенным образом увеличивается время циркуляции в крови [8].
Проведенные нами ранее исследования показали, что перспективным антиоксидантом из класса терпенофенолов является 2,6-диизоборнил-4-ме-тилфенол (I), обладающий антитромбогенной и гемореологической активностью [11—13]. Однако нерастворимость производных изоборнилфенолов в водных средах ограничивает их применение при создании фармпрепаратов.
Результаты О-алкилирования полиэтиленгликолей (Ш)—(У) 4-бромометил-2,6-диизоборнилфенола (II)
Исходный полимер Конъюгат (II), моль/моль ОН-группы ПЭГ ю*, масс. %
ПЭГ 1500, (III) (VIa) (VI6) 1.2 2.2 10.2 12.6
ПЭГ 6000, (IV) (VII) 1.2 0.8
ПЭГ 20000, (У) (VIII) 1.2 0.2
* ю — содержание 2,6-диизоборнил-4-метиленового фрагмента в конъюгате.
Удобным объектом для исследования антиок-сидантной и мембранопротекторной активности соединений являются эритроциты крови млекопитающих. На модели гемолиза эритроцитов, индуцированного пероксидом водорода либо гидрохлоридом 2,2'-азо-бис-2-амидинопропана, доказано наличие антиоксидантных и мембранопротекторных свойств у ряда полимеров различного происхождения и их производных [1, 14—16].
Целью данной работы является пегилирование производного 2,6-диизоборнилфенола с использованием полиэтиленгликолей различной длины и оценка антиоксидантной и мембранопротекторной активности полученных конъюгатов на
модели индуцированного гемолиза эритроцитов крови.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез конъюгатов (УЕ)-(УШ) осуществляли взаимодействием бромпроизводного (II) и полиэтиленгликолей (Ш)-(У) с различной длиной цепи в присутствии основания в DMSO при 35°С. Температурный режим был выбран на том основании, что для бромопроизводного (II) характерна сравнительно низкая растворимость в DMSO при температуре ниже 35°С.
(III), (VI) n = 32; (IV), (VII) n = 134; (V), (VIII) n = 452; R = H или R'
Схема.
Наиболее эффективно О-алкилирование протекает при мольном соотношении реагентов (II) и (III), равном 1.2 : 1. Дальнейшее увеличение содержания производного (II) в реакционной системе приводит лишь к незначительному возрастанию степени модификации исходного полимера. Затруднения, возникающие при алкилировании обеих концевых групп ПЭГ, могут объясняться, вероятно, пространственными факторами, связанными с объемной структурой молекулы терпенофенола. Кроме того в DMSO возможно протекание побочных окислительных процессов галогенсодержащих молекул [17]. Нами было установлено, что молекулярная масса ПЭГ не оказывает влияния на реак-
ционную способность полимера в выбранных условиях. При равных избытках алкилирующего агента получены образцы со сходным содержанием терпенофенола в пересчете на концевую группу ПЭГ (таблица).
Полученные конъюгаты (У[)—(УШ) с различным содержанием терпенофенольной части хорошо растворимы в воде и в большинстве органических растворителей. Содержание присоединенных фрагментов (ю, масс. %) в конъюгатах определяли по поглощению в электронных спектрах при 286 нм, отвечающему я—я*-переходам замещенных фенолов в водно-этанольной среде. В качестве стандарта для построения калибровочной
120 100 80 60 40 20 0
- % к контролю
12 (III)
1 Гемолиз □ ТБК-АП
Рис. 1. Относительная величина гемолиза и содержание ТБК-АП в суспензии эритроцитов (% от контроля), предварительно инкубированных с ПЭГ (III)— (V) в концентрациях 0.05 (1) и 0.5 мг/мл (2) , через 5 ч после внесения в среду Н2О2. В контрольных пробах индуцировали гемолиз без внесения исследуемых полимеров.
шкалы использован 2,6-диизоборнил-4-меток-симетиол фенол. В спектре 13С-ЯМР производных (У1)—(УШ) в области 70 м.д. присутствуют сигналы атомов углерода, относящиеся к С-ато-мам цепи ПЭГ, в спектрах 1Н-ЯМР этих же соединений наблюдаются сигналы протонов элементарного звена ПЭГ в области 3.64—3.67 м.д.
При сравнительной оценке мембранопротек-торной и антиоксидантной активности исходных полиэтиленгликолей (Ш)—(У) различной длины цепи было установлено, что они, как правило, не вызывают статистически значимого мембрано-протекторного эффекта в условиях Н2О2-индуци-рованного гемолиза эритроцитов крови, хотя способны в некоторой степени ингибировать накопление продуктов ПОЛ (рис. 1). Данные рис. 1 представлены по отношению к контрольным пробам, в которых индуцировали гемолиз без предварительного внесения исследуемых полимеров. Наличие выраженного мембранопротек-торного эффекта у этанольного раствора соединения (I) в широком диапазоне концентраций (0.001—0.1 мМ, 0.38—38 мкг/мл соответственно) было ранее экспериментально показано на той же модели [18].
Исследования конъюгатов (У1)—(УШ) в условиях Н202-индуцированного гемолиза эритроцитов крови показали высокую мембранопротек-торную активность отдельных соединений этого ряда, существенным образом зависящую от их концентрации. Данные соединения проявили
180 160 140 120 100 80 60 40 20 0
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
% к контролю
(а)
(VIa)
(VI6) (VII)
(VIII)
% к контролю (б)
(VIa)
(VI6) (VII)
(VIII)
Рис. 2. Относительная величина гемолиза эритроцитов (а) и относительное содержание ТБК-АП в суспензии эритроцитов (б), предварительно инкубированных с исследуемыми конъюгатами в концентрациях 0.05 (темные столбцы) и 0.5 мг/мл (светлые столбцы), через 5 (а) и через 4 ч (б) после внесения в среду Н2О2.
также способность ингибировать ПОЛ в суспензии эритроцитов (рис. 2).
Так, высокая мембранопротекторная активность в условиях Н2О2-индуцированного гемолиза эритроцитов крови была отмечена для соединений (VII) и (VIII), при этом степень ингибирования гемолиза была прямо пропорциональна концентрации препаратов в инкубационной среде. В концентрации 0.5 мг/мл эти вещества показали способность эффективно защищать клетки в течение всего периода инкубации (5 ч). В низких концентрациях наибольшую эффективность показало соединение (УЕб), так в концентрации 0.05 мг/мл его эффективность была максимальной из всех изученных соединений данного ряда (рис. 2а). В концентрации 0.5 мг/мл мембранопротекторный эффект конъюгата (УК) был гораздо ниже.
Соединение (УЕа) в обеих концентрациях оказывало выраженный мембранопротекторный эффект лишь в первые 2 ч после внесения в инкуба-
Контроль 0.05 мг/мл 0.5 мг/мл
Рис. 3. Влияние конъюгата (VIII) в концентрациях 0.05 и 0.5 мг/мл на относительное содержание метге-моглобина (темные столбцы) и феррилгемоглобина (светлые столбцы) при индуцированном Н2О2 гемолизе эритроцитов (через 5 ч инкубации).
ционную среду Н2О2, увеличивая, таким образом, период индукции развития окислительных повреждений. Однако в дальнейшем препарат не только не защищал эритроциты от гибели, но вызывал гемолиз, превосходящий эффект от внесения Н2О2 (рис. 2а).
Анализ данных, представленных на рис. 2б, свидетельствует о том, что для конъюгатов (УЕб), (VII) и (VIII) способность ингибировать ПОЛ в суспензии эритроцитов оказалась прямо пропорциональной концентрации вещества в среде инкубации. Для конъюгата (УГа) также была выявлена достаточно высокая антиоксидантная активность, причем наиболее высокая — при низкой концентрации соединения. Однако, как видно из рис. 2а, наличие высокой антиоксидант-ной активности у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.