научная статья по теме АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЦИТОСТАТИКОВ НА ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТКИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ Биология

Текст научной статьи на тему «АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЦИТОСТАТИКОВ НА ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТКИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 4, с. 268-277

БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХ =

УДК 611-013;57.086.835;577.218

АНТИПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ И ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЦИТОСТАТИКОВ НА ПЛЮРИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ И КЛЕТКИ ТЕРАТОКАРЦИНОМЫ МЫШИ

© 2012 г. О. Ф. Гордеева

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, д. 26

E-mail: olgagordeeva@yandex.ru Поступила в редакцию 21.01.12 г.

Окончательный вариант получен 20.02.2012 г.

Плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих способны неограниченно пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток в культуре in vitro. Однако дифференцировка плю-рипотентных клеток in vitro в большинстве случаев является асинхронной и неполной, а остаточные недифференцированные клетки при трансплантации реципиентам инициируют развитие тератом. Эти особенности плюрипотентных стволовых клеток ограничивают развитие безопасных технологий клеточной терапии на основе плюрипотентных стволовых клеток. Учитывая значительное сходство скорости роста плюрипотентных столовых и раковых клеток, мы исследовали антипролифера-тивные и цитотоксические эффекты различных типов цитостатиков (митомицина С, этопозида, винбластина, циклогексимида) на недифференцированные и дифференцирующиеся эмбриональные стволовые, эмбриональные герминативные клетки, клетки бластоцист мыши, а также на тера-токарциномные клетки и эмбриональные фибробласты мыши. Все использованные цитостатики наряду с антипролиферативными эффектами вызывали острые токсические процессы в недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках мыши и клетках тератокарциномы, тогда как в дифференцирующихся эмбриональных стволовых клетках и эмбриональных фибробластах их эффекты были значительно слабее. Кроме того, клетки трофобласта бластоцист мыши были менее чувствительны к повреждающим эффектам цитостатиков по сравнению с клетками внутренней клеточной массы. При изучении отсроченных эффектов цитостатиков на недифференцированные эмбриональные стволовые клетки и эмбриональные фибробласты было обнаружено, что воздействие митомицина, этопозида и винбластина, но не циклогексимида, является необратимым, и выжившие клетки не способны к дальнейшей пролиферации. Тем не менее, число эмбриональных фибробластов, обработанных этопозидом и винбластином, не изменялось, в то время как недифференцированные плюрипотентные клетки, практически полностью подвергались апоптозу. Таким образом, различные цитотоксические эффекты этопозида и винбластина на недифференцированные плюрипотентные клетки и дифференцированные эмбриональные клетки позволяют рассматривать эти цитостатики и их аналоги в качестве препаратов-кандидатов для разработки методов избирательной элиминации остаточных недифференцированных плюрипотентных клеток в популяции дифференцирующихся клеток. Полученные нами данные впервые демонстрируют возможность селективной элиминации недифференцированных плюрипотентных клеток с использованием низкомолекулярных цитостатиков, применяемых в клинической практике. Однако для увеличения эффективности и безопасности этого подхода и предотвращения мутагенных, канцерогенных и тератогенных эффектов цитостатиков на плюрипотентные стволовые клетки и их дифференцированные клетки-производные необходимы широкомасштабные исследования цитостатиче-ских эффектов при различных дозах и схемах воздействия.

Ключевые слова: эмбриональные стволовые клетки, бластоциста, эмбриональные герминативные клетки, тератокарцинома, цитостатики, митомицин, этопозид, винбластин, циклогексимид, рети-ноевая кислота, дифференцировка, цитотоксичность, эмбриотоксичность.

Плюрипотентные стволовые клетки млекопитающих способны активно и неограниченно пролиферировать и дифференцироваться в различные типы клеток в культуре in vitro. Скорость роста плюрипотентных стволовых клеток сопоставима с таковой для раковых клеток. Структура клеточного цикла плюрипотентных стволовых клеток имеет

уникальные характеристики и значительно отличается от клеточного цикла нормальных соматических клеток (8ауаИег й а1., 1994; 1996; Лгшапоуа й а1., 2002). Большую часть всего времени клеточного цикла плюрипотентные стволовые клетки находятся в ¿-фазе, а 01- и 02-периоды у них значительно сокращены по сравнению с соответствую-

щими фазами клеточного цикла соматических клеток. Фактически, разделившиеся клетки вступают в новый раунд репликации ДНК практически сразу после завершения предыдущего митоза (Savatier et al., 1994.1996; Burdon et al., 2002; Stead et al., 2002; White et al., 2005; Fluckiger et al., 2006; Becker et al., 2006; Гордеева и др., 2011). В отличие от раковых клеток плюрипотентные стволовые клетки способны к спонтанной и индуцированной дифференцировке. Однако даже при индуцированной различными факторами дифференцировке некоторые клетки остаются недифференцированными, т.е. дифференцировка плюрипотентных клеток in vitro в большинстве случаев является асинхронной и неполной (Brederlau et al., 2006; Boyd et al., 2008; Sundberg et al., 2011). Причины этого явления неясны, но оно в значительной мере ограничивает развитие технологий клеточной терапии на основе плюрипотентных стволовых клеток, т.к. остаточные недифференцированные клетки при трансплантации инициируют развитие тератом.

Для развития безопасных клеточных технологий на основе плюрипотеных стволовых клеток используют несколько стратегий, направленных на устранение остаточных недифференцированных клеток из популяции дифференцирующихся клеток. Селекция определенных клеточных типов с помощью клеточных сортеров и генетическая модификация клеточных линий с помощью различных "суицидальных" конструкций являются перспективными методами, однако имеют ряд недостатков, которые ограничивают их эффективность (Kiuru et al., 2009; Tang et al., 2011).

С другой стороны, для ингибирования пролиферации раковых клеток разработаны и продолжают разрабатываться препараты с различными механизмами действия (Vander Heiden, 2011). Учитывая значительное сходство скорости роста плюрипотентных столовых и раковых клеток, представляет интерес изучение эффектов различных групп цитостатических препаратов на недифференцированные и дифференцирующиеся плю-рипотентные стволовые клетки. В представленной работе исследованы эффекты различных типов цитостатиков, применяемых в клинической практике для химиотерапии различных опухолей: ал-килирующих агентов, образующих сшивки в структуре ДНК (митомицин С), ингибиторов то-поизомеразы II (этопозид), ингибиторов сборки микротрубочек (винбластин) и ингибиторов синтеза белков (циклогексимид). Задачей нашего исследования являлось изучение прямых и отсроченных антипролиферативных и токсических эффектов разных типов цитостатиков на

плюрипотеные эмбриональные стволовые (ЭСК), эмбриональные герминативные клетки (ЭГК) и клетки внутренней массы бластоцист мыши, а также на опухолевые клетки линии тератокарциномы (ЭТК) мыши и на нетрансформированные эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ).

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Культивирование клеток in vitro. В работе были использованы ЭСК мыши линии R1, ЭГК мыши линии EGC-10, любезно предоставленные доктором А. Макларен (А. McLaren, WTCR Institute of Cancer and Developmental Biology, Cambridge, UK). ЭТК мыши линии F9 получены из Российской коллекции клеточных культур (Банк клеточных культур Института цитологии РАН, Санкт-Петербург). Плюрипотентные клеточные линии мыши культивировали в среде DMEM, содержащей 1 мМ L-глутамина, 0.1 мМ заменимых аминокислот, 0.1 мМ ß-меркаптоэтанола и 15% телячьей фе-тальной сыворотки ("HyClone", США). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки мыши поддерживали на фидере из первичных эмбриональных фибробластов мыши, инактиви-рованных митомицином С (10 мкг/мл, "Sigma"). В течение экспериментов ЭСК и ЭГК мыши культивировали в бесфидерной системе, в среде с фактором ингибирования лейкемии (leukemia inhibitory factor, LIF, 10 нг/мл, "Sigma"). МЭФ и ЭТК F9 культивировали в среде для плюрипотентных клеток без LIF. Для изучения влияния цитостатиков на дифференцированные клетки ЭСК R1 предварительно индуцировали к дифференцировке рети-ноевой кислотой (10-6 М, "Sigma") в течение 3 суток. На 4 сутки культивирования среду, содержащую ретиноевую кислоту, заменяли на стандартную среду для культивирования плюрипо-тентных клеток и добавляли цитостатики.

Получение и культивирование доимплантацион-ных эмбрионов мышей. В работе использовали мышей линии C57Bl/6 из питомника лабораторных животных НПП "Пущино" ФИБХ РАН. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями биоэтического комитета Института. Для получения эмбрионов с датированным сроком беременности животных спаривали, день обнаружения копулятивной пробки считали стадией Е 0.5. Эмбрионы мышей на стадии бластоцисты (стадия E 4.0) извлекали из матки самки и культивировали в течение суток до их вылупления из блестящей оболочки в среде для культивирования плюрипо-тентных клеток в 4-луночных планшетах ("Nunc", Дания). В каждой группе использовали по 15 эмбрионов.

Изучение эффектов цитостатиков. Для изучения цитостатических эффектов использовали митоми-цин С, этопозид, винбластин, циклогексимид (все "Sigma"). На основании данных литературы из базы данных TOXNET, U.S. National Library of Medicine, National Institutes of Health (http://tox-net.nlm.nih.gov/) для используемых нами цитоста-тиков были выбраны активные дозы соответствующих препаратов: митомицин С — 10 мкг/мл, этопозид — 10 мкМ, винбластин — 10 мкг/мл, циклогексимид — 10 мкг/мл. Все эксперименты были повторены дважды.

ЭСК, ЭГК и ЭТК высевали на планшеты плотностью 20 тыс. клеток/см2 ("Greinerbio", Германия). После достижения культурами 30—40% кон-флюэнтности (через 30—33 ч) их культивировали в течение 24 ч в среде с цитостатиками, затем отмывали клетки средой и культивировали следующие 24 ч в среде без цитостатиков. По завершении эксперимента подсчитывали число живых клеток с помощью красителя трипанового синего. В выживших плюрипотентных и тератокарциномных клетках выявляли активность щелочной фосфата-зы. При изучении отсроченных эффекто

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком