МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2009, том 43, № 1, с. 103-110
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.21:577.112.4
АНТИРЕСТРИКЦИОННАЯ И АНТИМОДИФИКАЦИОННАЯ АКТИВНОСТИ БЕЛКА Oer (БАКТЕРИОФАГ T7): ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТНЫХ ЗАМЕН В ОБЛАСТИ ИНТЕРФЕЙСА
© 2009 г. Г. Б. Завильгельский*, В. Ю. Котова, С. М. Расторгуев
Государственный научный центр "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 Поступила в редакцию 05.06.2008 г.
Принята к печати 16.06.2008 г.
Белок Ocr, кодируемый геном 0.3 (oer) бактериофага Т7, специфический ингибитор ферментов АТР-зависимых систем рестрикции-модификации типа I. Ген 0.3 (oer) бактериофага T7 клонирован в муль-тикопийном векторе pUC18. Показано, что белок Ocr ингибирует и рестрикционную, и модификацион-ную активности системы рестрикции-модификации типа I (EcoKI) в клетках Escherichia eoli K12. Получен мутант Ocr F53D A57E, который способен ингибировать лишь рестрикционную активность EcoKI. Проведено клонирование генов 0.3 (oer) и luxCDABE Photorhabdus lumineseens в векторах серии pZ со строго регулируемым промотором PltetO.j под контролем репрессора TetR. Показано, что в зависимости от концентрации индуктора - ангидротетрациклина - в среде интенсивность биолюминесценции клеток E. eoli K12 MG1655Z1 tetR+ (pZE21-luxCDABE) и, соответственно, внутриклеточная концентрация лю-циферазы варьирует в широких пределах - до 5000 раз. Определена зависимость эффективности анти-рестрикционной активности белков Ocr и Ocr F53D A57E от их внутриклеточной концентрации. Показано, что константы диссоциации Kd, характеризующие формирование комплекса Ocr и Ocr F53D A57E с ферментом рестрикции-модификации типа I EcoKI, различаются в 1000 раз: Kd (Ocr) = 10-10 M; Kd (Ocr F53D A57E) = 10-7 M.
Ключевые слова: антирестрикционные белки, ферменты рестрикции-модификации типа I, ген агйА, ген 0.3 (осг), /ихСБАБЕ, биолюминесценция, люцифераза.
ANTIRESTRICTION AND ANTIMODIFICATION ACTIVITIES OF THE T7 Ocr PROTEIN: EFFECT OF MUTATIONS IN INTERFACE, by G. B. Zavilgelsky*, V. Yu. Kotova, S. M. Rastorguev (State Research Center "GosNIIgenetika", Moscow, 117545 Russia; *e-mail: zavilgel@genetika.ru). Antirestriction protein Ocr (bacteriophage T7) is specific inhibitor of the type I restriction-modification enzymes. The bacteriophage T7 0.3 (ocr) gene is cloned in pUC18 vector. It was shown that T7 Ocr protein inhibits both restriction and modification activities of the type I restriction-modification enzyme (EcoKI) in Escherichia coli K12 cells. The mutation form of Ocr-Ocr F53D A57E, which inhibits only the restriction activity of EcoKI-enzyme, was constructed. The T7 0.3 (ocr) and the Photorhabdus luminescens luxCDABE genes were cloned in pZ-series vectors with the Pueto-i promoter which is tightly repressible by the TetR repressor. Controlling the expression of the lux-genes encoding bacterial luciferase demonstrates that the PiteO_1 promoter can be regulated over an up to 5000 fold range by supplying anhydrotetracycline (aTc) to the E. coli MG1655Z1 tetR+ cells. It was determined the dependence of the effectiveness of the antirestriction activity of the Ocr and Ocr F53D A57E proteins on the intracellular concentration. It was shown that the values of the dissociation constants Kd for Ocr and Ocr F53D A57E proteins with EcoKI enzyme differ in 1000 times: Kd (Ocr) = 10-10 M, Kd (Ocr F53D A57E) = 10-7 M.
Key words: antirestriction proteins, type I restriction-modification enzymes, gene ardA, gene 0.3 (ocr), ZmxCDABE, bioluminescence, luciferase
Белок Oer, кодируемый геном 0.3 (ocr) бактериофага Т7, относится к семейству антирестрикцион-ных белков (антирестриктаз), которые специфически ингибируют ферменты АТР-зависимой системы рестрикции-модификации типа I [1-3]. К этому же семейству принадлежат белки группы ArdA, кодиру-
* Эл. почта: zavilgel@genetika.ru
емые генами ard (alleviation of restriction of DNA). Гены ard расположены в лидерной области конъюга-тивных плазмид, они одними из первых входят в клетку при конъюгативном переносе ДНК [4, 5].
Гены 0.3 (ocr) и ard ответственны за синтез небольших по размеру (Ocr - 116 аминокислотных остатков, ArdA - 160-170 аминокислотных остатков) очень кислых белков (суммарный заряд моле-
кулы равен -25.. .-30). Гены 0.3 (ocr) и ard обеспечивают повышенную эффективность инфекции (бактериофаг) и конъюгативного переноса ДНК (плазмида) между бактериальными клетками разных видов и родов, помогая бактериофагу и трансмиссивным плазмидам преодолевать рестрикци-оннные барьеры
Антирестрикционные белки относятся к семейству ДНК-мимикрирующих белков (protein mimicry of DNA), пространственная палочкоподобная структура которых имитирует B-форму двуспиральной ДНК [6-8]. Мимикрия белка под двуспиральную ДНК позволяет антирестриктазе конкурировать с ДНК за место связывания с ферментом рестрикции-модификации и тем самым ингибировать процессы деградации (рестрикции) и метилирования (модификации) ДНК. С позиций классического ферментативного катализа механизм антирестрикции служит примером конкурентного ингибирования, осуществляемого молекулой-ингибитором за счет структурного подобия с природным субстратом.
По функциональной активности белки ArdA и Ocr практически не различаются, так как специфически ингибируют лишь ферменты рестрикции-модификации типа I. Однако, если у белков ArdA существуют мутантные формы (как природные, так и полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза), ингибирующие лишь эндонуклеазную (ре-стрикционную), но не метилазную (модификацион-ную) активность фермента рестрикции-модификации типа I [9-11], то подобные мутантные формы белка Ocr не получены. Необходимо отметить, что получен ряд мутантных белков Ocr [12], однако их антирестрикционная активность была не меньше, чем у нативного белка. Определение пространственной структуры димерной формы белка Ocr показало [6], что прочный контакт между мономерами определяется гидрофобным кластером из семи аминокислотных остатков .. .52IFS VMAS... Мы предположили, что при ослаблении или нарушении этого контакта может измениться или нарушиться димер-ная форма белка, и такой мутантный белок не сможет ингибировать метилазную, а, возможно, и эндонуклеазную активности фермента рестрикции-модификации.
В представленной работе с помощью сайт-направленного мутагенеза получены мутантные формы белка Ocr с заменами аминокислотных остатков в области интерфейса (52IFSVMAS). Ген 0.3(ocr) дикого типа и его мутантные аллели клонированы под строго регулируемым промотором. Измерена антирестрикционная и антимодификационная активность Ocr в зависимости от концентрации белка-ингибитора в бактериальной клетке.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Бактериальные штаммы, бактериофаги и плаз-миды. В работе использовали штамм Escherichia coli K12 MG1655 Z1, который содержит в составе хромосомы ген, кодирующий TetR, белок-репрессор промотора PtetA. Этот штамм получен трансдукцией с помощью фага P1. В качестве донора использовали E. coli DH5aZ1 tetR, в геноме которого ген tetR тесно (90% котрансдукции) сцеплен с геном, определяющим устойчивость бактерии к спектиномицину.
Использовали также следующие штаммы E. coli K-12: JM109 recA1 endA1 gyrA96 thi supE44 relA1 hsdR17 A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15]; TG-1 thi relA supE44 hsdR17 hsdM A(lac-proAB) [F'traD36 proAB lacIqZ AM15]; AB1157 F- thr-1, leu-6, proA2, his-4, thi-1, argE3, lacY1, galK2, ara14, xyl-5, mtl-1, tsx-33, rpsL31, supE44, r+ m+; E. coli Cs romo (про-тотроф). Все штаммы получены из коллекции "Го-сНИИгенетика".
Бактериофаги Р1 и Т7 получены из коллекции "ГосНИИгенетика". Бактериофаг X^ получен от Р. Деворе (Франция). В работе использовали немо-дифицированные фаги X.0 и модифицированные фаги X.K, выращенные на E. coli Cs (или TG-1) и E. coli K12 AB1157 соответственно.
В качестве векторов, содержащих строго регулируемый промотор, использовали векторы серии pZ с репликонами ColE1 (pZE21 Knr) и pSC101 (pZS33 Cmr) и копийностью 60-70 и 8-10 копий на клетку соответственно [13]. В качестве строго регулируемой промоторной-операторной области в векторы встроен фрагмент ДНК, содержащий P¡telO_1.
Промотор Plteto- 1 состоит из промоторной части Pl из генома фага X и операторной части tetO2 из ре-гуляторной области оперона тетрациклинустойчи-вости транспозона Tn10 [13]. Векторы pZE21 Knr и pZS33 Cmr содержат также последовательность Шайна-Дальгарно (RBS) и полилинкер, служащий для встраивания фрагмента ДНК, содержащего исследуемый ген.
В работе использовали также векторы серий pUC. Мультикопийные плазмиды выделяли щелочным методом согласно [14].
Среды, ферменты, реактивы. Для выращивания культур и в опытах по клонированию использовали L-бульон и L-агар, а также ампициллин (100 мкг/мл), канамицин (40 мкг/мл), хлорамфеникол (15 мкг/мл). Реакции расщепления и лигирования проводили с использованием ферментов фирмы "Fermentas" (Литва). Клетки E. coli трансформировали кальциевым методом согласно [14]. В качестве индуктора экспрессии генов в клетках E. coli MG1655Z1, несущих гибридные плазмиды серии pZ, использовали ангидротетрациклин ("Sigma").
Конструирование плазмид. Источником гена 0.3 (ocr) служила ДНК бактериофага Т7. Эндонук-леолитическое расщепление, лигирование фраг-
ментов ДНК, электрофорез в агарозном геле, выделение фрагментов ДНК из агарозного геля проводили согласно [14].
Ген 0.3 (ocr) T7 клонировали в векторе pUC18 с использованием в качестве праймеров олиго-нуклеотидов:
BamHI
Ndir 5'-TTATGGGATCCACTAATAACTGCAC-3' и
HindIII
Nrev 5'-CCGTATTGAAGCTTGGTAGTAGAC-3' - c последующим накоплением продуктов с помощью ПЦР.
Для мутационного замещения в гидрофобном кластере белка Ocr A57E в качестве праймеров использовали олигонуклеотиды:
(1) 5'-AGCGTAATGGAAGTGAGGGCA-3',
(2) 5'-TGCCCTCACTTJCCATTACGCT-3'.
Для мутационного замещения в белке Ocr F53D в качестве праймеров использовали олиго-нуклеотиды:
(3) 5'-GCTGACATCGAJAGCGTAATGGAAA-3',
(4) 5'-CACTTTCCATTACGCTAJCGATGTC-3'.
Нуклеотиды, некомплементарные матрице, выделены курсивом и подчеркнуты. Правильность нуклеотидных последовательностей мутированных копий гена 0.3(ocr) по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.