БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1999. том 25, № 3, с. 171-178
УДК 616-097:577.112:856:577.112.6.083.3
АНТИТЕЛА ПРОТИВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ Т-КАДГЕРИНА ПОДАВЛЯЮТ СВЯЗЫВАНИЕ ЛИПОПРОТЕИДОВ НИЗКОЙ ПЛОТНОСТИ С Т-КАДГЕРИНОМ
© 1999 г. М. В. Сидорова*, А. С. Молокоедов, А. А. Азьмуко, Д. В. Стамбольский, Н. М. Каширина, В. Н. Бочков, В. А. Ткачук, Ж. Д. Беспалова
Российский кардиологический научно-производственный комплекс МЗ РФ, 121552, Москва, 3-я Черепковская, 15а Поступила в редакцию 15.05.98 г. Принята к печати 27.10.98 г.
Твердофазным методом с использованием Ртос-методологии осуществлен синтез пептидов последовательности потенциальных антигенных детерминант атипичных липопротеидсвязывающих белков Т-кадгерина (р 105) и его предшественника (р 130) из гладкомышечных клеток сосудов человека. Полученные пептиды соответствуют участкам 51-61, 140-160, 161-179, 260-271, 340-352, 350-362 и 370-385 аминокислотной последовательности белка р 130. Выбор пептидов основывался на результатах компьютерного анализа антигенной структуры белка. Конъюгаты пептидов с пероксидазой хрена были использованы для иммунизации кроликов и мышей. С помощью иммунного блоттинга показано, что антисыворотки .против пептидов, соответствующих фрагментам 140-160, 161-179 и 260-271, взаимодействуют с белком р105, выделенным из гладкомышечных клеток сосудов, ранее идентифицированным нами какТ-кадгерин. Эти антисыворотки дозозависимо ингибировали связывание ли-попротеидов низкой плотности с р 105. Полученные данные подтверждают правильность идентификации белка рЮ5 как Т-кадгерина и демонстрируют принципиальную возможность изучения взаимодействия этого белка с ЛНП с помощью ингибирующих связывание противопептидных антител.
Ключевые слова: антигенная детерминанта; Т-кадгерин; синтетические пептиды; твердофазный синтез; конъюгаты.
Липопротеиды низкой плотности - это сложный надмолекулярный комплекс, участвующий в переносе холестерина и других липидов в организме. Накопление атерогенных частиц ЛНП в сосудистой стенке - характерный симптом атеросклероза. Несмотря на обилие посвященных этой теме работ, механизмы проникновения ЛНП в стенки сосудов и их накопления ясны лишь частично. Ранее мы обнаружили в гладкомышечных клетках сосудов человека атипичные липопроте-идсвязывающие белки р 105 и р130 с молекулярными массами 105 и 130 кДа [1], по лигандной селективности значительно отличающиеся от известных липопротеидных рецепторов [2]. Нам удалось очистить белки р 105 и р130 и определить частич-
Исггользованы сокращения, рекомендованные комиссией IUPAC-IUB (Eur. J. Biochem. 1984. V. 183. P. 9-37), а также: Acm - ацетамидометил; CH^CN - ацетонитрил; DCM - ди-ХЛОрметан; DIC - A/jV-диизопропилкарбодиимид; DMA -V..Y-диметилацетамид; DMF - /У./У-диметилформамид; Dod -бис(4-метоксифенил)метил; EDT- 1,2-этандитиол; ESI-MS -ыасс-спектрометрия с электроспрейным ионным источником: Ктос - 9-флуоренилметилоксикарбонил: HOBt- 1-гид-рокснбензотриазо.т. Mtr - 4-метокси-2,3,6-триметилбснзол-сульфонил; NMP - Д'-ме тнлпирролидон; TFA - трифторук-сусная кислота: ЛНП - липопротеиды низкой плотности. Автор для переписки (тел.: 414-67-16; факс: 414-67-86; e-mail: sag@mail.infoiel.ru i.
ные аминокислотные последовательности фрагментов их протеолитического расщепления [3]. Сравнение полученных сиквенсов со структурами, представленными в базах Б'\¥188-Р1ЮТ и вепБапк показало, что аминокислотные последовательности этих фрагментов идентичны последовательности белка Т-кадгерина [4], одного из членов суперсемейства кадгеринов [5] и его предшественника [6, 7]. На рис. 1 представлена аминокислотная последовательность предшественника Т-кадгерина -белка р130 (номер в СепВапк Ь34058). Кадгерины представляют собой экспонированные на поверхности клеток белки, опосредующие кальцийзави-симое межклеточное связывание [8]. Принято считать, что специфичность межклеточного узнавания определяется способностью кадгеринов избирательно взаимодействовать с кадгеринами аналогичного типа, расположенными на соседних клетках [8]. Наши данные [2] позволяют предположить, что лигандная селективность кадгеринов является более широкой, чем считалось до сих пор, поскольку Т-кадгерин может связывать не только другие молекулы Т-кадгерина, но и растворимый лиганд - ЛНП. Не исключено, что такое связывание может вносить определенный вклад в накопление липопротеидов в стенке сосуда. Кроме того, полученные нами ранее результаты поз-
1 10 20 H-Met-GIn-Pro-Arg-Thr-Pro-Leu-Val-Leu-Cys-Val-Leu-Leu-Ser-GIn-Val-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Ala-Glu- Asp--* р130
30 40
-Leu-Asp-Cys-Thr-Pro-Gly-Phe-GIn-GIn-Lys-Val-Phe-His-lle-Asn-GIn-Pro-Ala-Glu-Phe-lle-Glu-Asp-GIn-Ser-50 60 70
-lle-Leu-Asn-Leu-Thr-Phe-Ser-Asp-Cvs-Lvs-Gly-Asn-Asp-Lvs-Leu-Arq-Tvr-Glu-Val-Ser-Ser-Pro-Tvr-Phe-
80 90
-Lys--Val-Asn-Ser-Asp-Gly-Gly-Leu-Val-Ala-Leu-Arg-Asn-lle-Thr-Ala-Val-Gly-Lys-Thr-Leu-Phe-Val-H¡s- Ala-100 110 120 -Arg-Thr-Pro-His-Ala-Glu-Asp-Met-Ala-Glu-Leu-Val-lle-Val-Gly-Gly-Lys-Asp-lle-GIn-Gly-Ser-Leu-GIn-Asp-
130 140
-lle-Phe-Lvs-Phe-Ala-Arq-Thr-Ser-Pro-Val-Pro-Arfl-GIn-Lys-ArQ-Ser-lle-Val-Val-Ser-Pro-lle-Leu-lle-Pro-
t -► p105
150 160 1 170
Glu-Asn-Gln-Arq-Gln-Pro-Phe-Pro-Arq-Asp-Val-Gly-Lvs-Val-Val-Asp-Ser-Asp-Arq-Pro-Glu-Ara-Ser-Lvs-Phe-
180 190
-Arg-Leu-Thr-GIv-Lvs-GIv-Val-Asp-GIn-Glu-Pro-Lys-Gly-lle-Phe-Arg-lle-Asn-Glu-Asn-Thr-GIv-Ser-Val-Ser-200 210 220 -Val-Thr-Arg-Thr-Leu-Asp-Arg-Glu-Val-lle-Ala-Val-Tyr-GIn-Leu-Phe-Val-Glu-Thr-Thr-Asp-Val-Asn-Gly- Lys-
230 240
-Thr-Leu-Glu-Gly-Pro-Val-Pro-Leu-Glu-Val-lle-Val-lle-Asp-GIn-Asn-Asp-Asn-Arg-Pro-lle-Phe-Arg-Glu-Gly-
250 260 270
-Pro-Tyr-lle-GIv-His-Val-Met-Glu-GIv-Ser-Pro-Thr-GIv-Thr-Thr-Val-Met-Arg-Met-Thr-Ala-Phe-Asp-Ala-Asp-
280 290
-Asp-Pro-Ala-Thr-Asp-Asn-Ala-Leu-Leu-Arg-Tyr-Asn-lle-Arg-GIn-GIn-Thr-Pro-Asp-Lys-Pro-Ser-Pro-Asn-Met-
300 310 320
-Phe-Tyr-lle-Asp-Pro-Glu-Lys-Gly-Asp-lle-Val-Thr-Val-Val-Ser-Pro-Ala-Leu-Leu-Asp-Arg-Glu-Thr-Leu-Glu-
330 340
-Asn-Pro-Lys-Tyr-Glu-Leu-lle-lle- Glu-Ala-Gln-Asp-Met-Ala-Glv-Leu-Asp-Val-Glv-Leu-Thr-Glv-Thr-Ala-Thr-
350 360 370
-Ala-Thr-lle-Met-lle-Asp-Asp-Lvs-Asn-Asp-His-Ser-Pro-Lvs-Phe-Thr-Lvs-Lvs-Glu-Phe-GIn -Ala-Thr-Val-Glu-
380 " ~ 390
-Glu-GIv-Ala-Val-GIv-Val-lle-Val-Asn-Leu-Thr-Val-Glu-Asp-Lys-Asp-Asp-Pro-Thr-Thr-GIv-Ala-Trp-Arq-Ala-
400 410 420
-Ala-Tyr-Thr-lle-lle-Asn-Gly-Asn-Pro-Gly-GIn-Ser-Phe-Glu-lle-His-Thr-Asn-Pro-GIn-Thr-Asn-Glu-Gly-Met-
430 440
-Leu-Ser-Val-Val-Lys-Pro-Leu-Asp-Tyr-Glu-lle-Ser-Ala-Phe-His-Thr-Leu-Leu-lle-Lys-Val-Glu-Asn-Glu-Asp-
450 460 470
-Pro-Leu- Val-Pro-Asp-Val-Ser-Tyr-Gly-Pro-Ser-Ser-Thr-Ala-Thr-Val-His-lle-Thr-Val-Leu-Asp-Val-Asn-Glu-
480 490
-Gly-Pro-Val-Phe-Tyr-Pro-Asp-Pro-Met-Met-Val-Thr-Arg-GIn-Glu-Asp-Leu-Ser-Val-Gly-Ser-Val-Leu-Leu-
500 510 520
-Thr-Val-Asn-Ala-Thr-Asp-Pro-Asp-Ser-Leu-GIn-His-GIn-Thr-lle-Arg-Tyr-Ser-Val-Tyr-Lys-Asp-Pro-Ala-Gly-
530 540
-Trp-Leu-Asn-lle-Asn-Pro-lle-Asn-Gly-Thr-Val-Asp-Thr-Thr-Ala-Val-Leu-Asp-Arg-Glu-Ser-Pro-Phe-Val-Asp-
550 560 570
-Asn-Ser-Val-Tyr-Thr-Ala-Leu-Phe-Leu-Ala-lle-Asp-Ser-Gly-Asn-Pro-Pro-Ala-Thr-Gly-Thr-Gly-Thr-Leu-Leu-
580 590
-lle-Thr-Leu-Glu-Asp-Val-Asn-Asp-Asn-Ala-Pro-Phe-lle-Tyr-Pro-Thr-Val-Ala-Glu-Val-Cys-Asp-Asp-Ala-Lys-600 610 620 -Asn-Leu-Ser-Val-Val-lle-Leu-Gly-Ala-Ser-Asp-Lys-Asp-Leu-His-Pro-Asn-Thr-Asp-Pro-Phe-Lys-Phe-Glu-
630 640
-lle-His-Lys-GIn-Ala-Val-Pro-Asp-Lys-Val-Trp-Lys-lle-Ser-Lys-lle-Asn-Asn-Thr-His-Ala-Leu-Val-Ser-Leu-650 660 670
-Leu-GIn-Asn-Leu-Asn-Lys-Ala-Asn-Tyr-Asn-Leu-Pro-lle-Met-Val-Thr-Asp-Ser-Gly-Lys-Pro-Pro-Met-Thr-
680 690
-Asn-lle-Thr-Asp-Leu-Arg-Val-GIn-Val-Cys-Ser-Cys-Arg-Asn-Ser-Lys- Val-Asp-Cys-Asn-Ala-Ala-Gly-Ala-
700 710
Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-Pro-Ser-Va!-Leu-Leu-Leu-Ser-Leu-Phe-Ser- Leu-Ala-Cys-Leu-OH
Рис. 1. Аминокислотная последовательность Т-кадгерина (белок р 105) и его предшественника (белок р 130) (номер регистрации в GeriBank L34058). Нумерация аминокислотных остатков соответствует белку р130. Стрелкой показано место протеолитического расщепления белка-предшественника. Подчеркнуты последовательности, соответствующие синтезированным в настоящей работе пептидным фрагментам.
200 300 400 500 600 Аминокислотная последовательность
700
Рис. 2. Анализ антигенной структуры предшественника Т-кадгерина - белка р 130 с использованием компьютерных методов: профиль гидрофильное™ (а), поверхностной доступности (б) и статистической антигенности (в). Выбранные для синтеза участки аминокислотной последовательности белка затемнены.
воляют предположить, что взаимодействие ЛНП с Т-кадгерином может приводить к активации в гладкомышечных клетках сосудов систем внутриклеточной сигнализации, регулирующих сократительную функцию этих клеток, а также их миграцию. пролиферацию и другие процессы, потенциально вовлеченные в атерогенез [9].
Для выяснения роли Т-кадгерина в метаболизме лнпопротеидов и регуляции систем вторичных посредников необходимы антитела против этого 'елка. Г-Кадгерин, как и многие другие белки клеточной мембраны, является минорным белком, Поэтому его выделение в количествах, достаточных для иммунизации, представляет определенную сложность. Поскольку в настоящее время, для получения антител, взаимодействующих с нативными белками, широко используются синтетические пептиды, моделирующие их антигенные детерминанты, в данной работе нами была предпринята попытка получить антитела про-
тив синтетических пептидных фрагментов Т-кадгерина и изучить их взаимодействие с белком в иммунохимических тестах.
Для анализа антигенной структуры Т-кадгерина и выбора потенциальных антигенных детерминант использованы компьютерные методы, хорошо зарекомендовавшие себя для предсказания линейных эпитопов в белках [10]: метод предсказания гидрофильных участков аминокислотной цепи [11], метод оценки поверхностной доступности [12] и статистический метод, учитывающий встречаемость различных сочетаний аминокислот в известных антигенных детерминантах [13] (рис. 2). Расчет проводился с помощью пакета программ "Peptide Companion". Кроме того, учитывались данные об участках гликозилирования Т-кадгерина [14].
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.