МИКРОБИОЛОГИЯ, 2009, том 78, № 3, с. 355-361
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.288:577.18
АНТИТРЕМЕЛЛОМИЦЕТОВАЯ АКТИВНОСТЬ МИКОЦИНА
сяуртососст ртш
© 2009 г. В. И. Голубев1
Всероссийская коллекция микроорганизмов, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 17.06.2008 г.
Секретируемый СтурЮсвссш р1нш микоцин с молекулярной массой не менее 15 кДа проявляет фунгицид-ную активность при значениях рН среды ниже 6.5. Он термолабилен и протеазоусгойчив. Чувствительны к нему тремелломицеты, виды которых сосредоточены в порядках Filobasidiales и TremeПales.
Ключевые слова: микоцинотипирование, таксономия, идентификация, Filobasidiales, Tremellales.
Антагонистические взаимоотношения, обусловленные образованием антибиотических веществ, весьма обычны в микробном мире, включая и дрожжевые грибы [1]. Среди последних широко распространена, в частности, микоциногения, т.е. синтез белковых веществ, получивших название микоци-нов (киллер-токсинов) [2]. Принципиальной их особенностью является таксоноспецифичность: к ним чувствительны лишь филогенетически родственные продуцентам микоцинов организмы. Микоциногения, очевидно, призвана обеспечить конкурентоспособность в микробных сообществах против близких видов, имеющих сходные потребности и экологические ниши. Выявленное к настоящему времени широкое распространение микоциноген-ных дрожжей [3, 4] побуждает пересматривать сложившиеся представления о роли этих одноклеточных грибов в природных биоценозах. Наряду с этим таксоноспецифичность микоцинов может быть использована в таксономических и диагностических целях [5, 6]. Последнее весьма актуально, поскольку в настоящее время растет разрыв между таксономией микроорганизмов и ее практическим приложением - идентификацией. Нередко вновь описываемые таксоны, выявляемые молекулярно-биологически-ми методами, практически невозможно дифференцировать общепринятыми стандартными способами. Высокие затратность и трудоемкость молеку-лярно-биологических методов ограничивают их использование в работах (например, экологических, эпидемиологических), где имеют дело с сотнями-тысячами изолятов. Сейчас испытывается острая необходимость в диагностических критериях, коррелирующих с современными таксономическими данными и, в то же время, представляющих возможность тестирования одновременно большого количества
1 Адресат для корреапонденции (e-mail: wig@ibpm.pushchi-no.ru).
культур в минимально оборудованных лабораториях. К числу таких подходов у дрожжевых грибов можно отнести микоцинотипирование - определение их чувствительности к микоцинам.
В зависимости от микоцина степень родства чувствительных к нему организмов может сильно различаться: от штаммов внутри вида до представителей близких порядков, т.е. применение микоцинов в диагностических целях требует предварительного определения таксономического уровня, в пределах которого они проявляют активность. Кроме того, весьма важен подбор соответствующих микоцино-генных культур, они должны быть различны, но в той или иной степени таксономически родственны исследуемым штаммам. Не имеет смысла, например, тестировать аскомицетные дрожжи с помощью базидиомицетных и наоборот. С увеличением же количества микоцинов и при релевантном их наборе разрешающая способность микоцинотипирования возрастает [7]. Эти обстоятельства диктуют необходимость использования при идентификации значительного количества микоциногенных штаммов с известными и разными спектрами действия.
Микоциногения выявлена у недавно описанного вида Cryptococcus pinus Golubev et Pfeiffer [8]. В настоящей работе изучены некоторые характеристики секретируемого им микоцина и детально обследован спектр действия в сравнении с микоцинами других видов криптококков [7, 9].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы. В работе использованы культуры в основном из Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ, http://www.vkm.ru).
Получение и характеристика токсина. Штамм ВКМ Y-2958 инкубировали неделю на качалке (150 об/мин, 20°С) в глюкозо-пептонной среде
355
5*
Динамика гибели клеток Cryptococcus terreus ВКМ Y-2253 (% от исходной концентрации 4 х 103 кл/мл) при инкубации (20°С) в микоцин-содержащей культу-ральной жидкости Cryptococcuspinus ВКМ Y-2958.
(рН 4.5) [9]. Клетки отделяли центрифугированием (5000 g, 10 мин), супернатант фильтровали через стеклобумагу GF/A ("Whatman", Великобритания), и полученную активную культуральную жидкость использовали для оценки действия токсина на жизнеспособность чувствительных дрожжей, что в про-
Таблица 1. Аскомицетные дрожжи (54 вида), исследованные на чувствительность к микоцину Cryptococcus pinus
Aciculoconidium Kluyveromyces Schizoblastosporion
Arthroascus Lachancea Schizosaccharomyces
Arxula Lipomyces Stephanoascus
Ambrosiozyma Lodderomyces Taphrina
Arxiozyma Mastigomyces Tetrapisispora
Brettanomyces Metschnikowia Torulaspora
Candida Nadsonia Trigonopsis
Citeromyces Nakaseomyces Vanderwaltozyma
Clavispora Naumovia Wickerhamia
Debaryomyces Nematospora Wickerhamiella
Dekkera Oosporidium Williopsis
Endomyces Pachysolen Wingea
Guilliermondella Pichia Yarrowia
Hanseniaspora Protomyces Zygoascus
Hormoascus Saccharomyces Zygosaccharomyces
Issatchenkia Saccharomycodes Zygotorulaspora
Kazachastania Saturnispora Zygowilliopsis
Kloeckera
цессе инкубации в ней дрожжей определяли высевами на сусло-агар (СА). Эта культуральная жидкость использована также для проверки устойчивости токсина к повышенной температуре и протеолизу методом лунок в агаре. Для оценки молекулярной массы токсина штамм ВКМ Y-2958 неделю выращивали на глюкозо-пептонном агаре (ГПА, рН 4.5), покрытом диализными мембранами, пропускающими вещества определенной молекулярной массы ("Spectrum", CffiA), затем мембрану вместе со штрих-культурой этого штамма удаляли и поверхность ГПА засевали газоном чувствительных дрожжей.
Элиминация антифунгальной активности.
0.1 мл клеточной суспензии (104 кл/мл) штамма ВКМ Y-2958 высевали на С А и инкубировали при максимальной для его роста температуре. Случайно отобранные выросшие колонии проверяли на наличие антифунгальной активности.
Тестирование чувствительности выращенных на СА трехсуточных культур осуществляли методом "культура против культуры" на ГПА с цитрат-фосфатным буфером (рН 4.5) [9].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Среди 15 изолятов С. pinus [8] антифунгальная активность обнаружена лишь у штамма Ps-38 (=BKM Y-2958). Эта активность проявляется только при пониженных значениях рН среды, в диапазоне от 3.5 до 6.5. Судя по ширине зон подавления роста, максимальна она при рН 4.5.
Секретируемый антифунгальный фактор устойчив к действию протеаз Е, Р, XII и XIX ("Sigma", США), но полностью инактивировался после 5-мин прогревания при 100°С. Он не диффундировал через диализные мембраны, не пропускающие соединения с молекулярной массой 15 кДа.
Данный фактор летален для чувствительных к нему дрожжей, о чем свидетельствует образование синей каймы на их газоне вокруг зоны подавления роста при тестировании на ГПА с метиленовым синим (0.03 г/л). Непосредственно фунгицидное его действие демонстрирует рисунок.
Проверка более 80 колоний, выросших при максимальной для роста штамма ВКМ Y-2958 температуре (32°С), не выявила среди них утративших антибиотическую активность.
На чувствительность к исследованному фактору обследованы 314 штаммов грибов, принадлежащие к 204 видам 120 родов. Все представители Ascomyco-ta (табл. 1) к нему устойчивы, а среди Basidiomycota чувствительные как телеоморфные, так и анаморф-ные организмы, сосредоточены в порядках Filoba-sidiales и Tremellales класса Tremellomycetes (табл. 2, 3). Члены других классов, порядков бази-диомицетов устойчивы или же изредка слабо чувствительны. Аналогична ситуация и внутри рода
AHTHTPEMEnnOMHÑETOBAü AKTHBHOCTb MHKOÑHHA CRYPTOCOCCUS PINUS 357
Ta6.i^a 2. CneKTp flencTBHfl MHKou^HHa Cryptococcus pinus cpe^H 6a3H^HOMHu,eTOB
Agaricomycotina Kondoa malvinella BKM Y-1568, 1569 -
Agaricomycetes IJU7 Atractiellomycetes
Sebacinales Sebacina penetrans BKM Y-2689 - Atractiellales Atractogloea stillata BKM Y-2693 c
Dacrymycetes Cystobasidiomycetes
Dacrymycetales Dacrymyces stillatus BKM F-2953 - Erythrobasidiales Erythrobasidium hasegawianum c
BKM Y-2802
Tremellomycetes Sakaguchia dacryoides BKM Y- c
2702, 2703
Cystofilobasidiales Cystofllobasidium bisporidii BKM Y-2700 - Microbotryomycetes
Mrakia curviuscula BKM Y-2953 - Leucosporidiales Curvibasidium pallidicorallinum -
BKM Y-2284, 2861
M. frigida BKM Y-1455 - Leucosporidium scottii BKM Y-68, -
2774
M. gelida BKM Y-2699 - Mastigobasidium intermedium BKM -
Y-2720
Xanthophyllomyces dendrorhous BKM Y- - Microbotryales Microbotryum scorzonerae RBF 855 -
2274, 2786
Filobasidiales Filobasidium capsuligenum BKM Y-1439 - M. silene-inflatae BKM F-2974, 3319 -
F. capsuligenum BKM Y-1513 + M. vinosa BKM F-2973 c
F. elegans BKM Y-2916 - M. violaceum BKM F-2976, 3318 -
F. floriforme BKM Y-2257 + Sphacelotheca polygoni-persicariae c
BKM Y-2691
F. globisporum BKM Y-2798 c Sporidiobolales Rhodosporidium babjevae BKM Y- -
2275,2276
F. uniguttulatum BKM Y-1597 + R. toruloides BKM Y-333, 334 -
Tremellales Bulleromyces albus BKM Y-2141 + Sporidiobolus johnsonii BKM Y- -
2606
Fibulobasidium inconspicuum BKM + S. salmonicolor BKM Y-679, 685 -
Y-2732
Filobasidiella neoformans IGC 3957, 4208 + Pucciniomycetes
Holtermannia corniformis BKM Y-2803, - Septobasidiales Septobasidium carestianum BKM c
2804 Y-2690
Kwoniella mangroviensis BKM Y-2959, - Platygloales Platygloea peniophorae BKM -
2960 Y-2688
Papiliotrema bandonii BKM Y-2917 + Puccinales Endophyllum sempervivi c
BKM Y-2695
Sirobasidium magnum BKM Y-2730, 2731 c Gymnosporangium clavarieforme c
BKM Y-2687
Sterigmatosporidium polymorphum BKM + Puccinia bupleuri BKM F-2979 c
Y-2585
Tremella aurantia BKM Y-2678 + P. suaveolens BKM F-2980 c
T. encephala BKM Y-2679 + Ustilaginomycotina
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.