научная статья по теме АПОПТОЗ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА В ПРЕЗУМПТИВНОЙ НЕЙРАЛЬНОЙ СЕТЧАТКЕ И ПРЕЗУМПТИВНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ СЕТЧАТКИ В РАННЕМ РАЗВИТИИ ГЛАЗА У ЖАБЫ BUFO RADDEI STRAUCH Биология

Текст научной статьи на тему «АПОПТОЗ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА В ПРЕЗУМПТИВНОЙ НЕЙРАЛЬНОЙ СЕТЧАТКЕ И ПРЕЗУМПТИВНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ СЕТЧАТКИ В РАННЕМ РАЗВИТИИ ГЛАЗА У ЖАБЫ BUFO RADDEI STRAUCH»

ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 6, с. 436-446

_ МЕХАНИЗМЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ _

-И ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ КЛЕТОК-

УДК 591

АПОПТОЗ И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА В ПРЕЗУМПТИВНОЙ НЕЙРАЛЬНОЙ СЕТЧАТКЕ И ПРЕЗУМПТИВНОМ ПИГМЕНТНОМ ЭПИТЕЛИИ СЕТЧАТКИ В РАННЕМ РАЗВИТИИ ГЛАЗА У ЖАБЫ

Bufo raddei STRAUCH © 2012 г. В. Хан*, И.-П. Хан**, З.-Р. Ванг*

*Институт биологии развития, Факультет наук о жизни, Университете Ланжоу, Ланжоу 730000, Китайская Народная Республика **Колледж Наук о жизни и Технологии, Университет Лангдонг, Кингианг 734000, Китайская Народная Республика E-mail: wangzr@lzu.edu.cn Поступила в редакцию 29.03.11 г. Окончательный вариант получен 18.10.11 г.

Проведено изучение апоптоза и дифференцировки в презумптивной нейральной сетчатке (ПНС) и презумптивном пигментном эпителии сетчатки (ППЭС) у жабы Bufo raddei Strauch. Окраска TUNEL была использована для оценки апоптозных клеток и иммуногистохимия для оценки уровня экспрессии глиального фибриллярного кислого белка (GFAP), RT97 и тирозиназы (Tyr) в раннем развитии глаза. Плотность апоптозных клеток и уровень экспрессии белка были оценены количественно с помощью программы Image-Pro Plus 6.0. Апоптоз был обнаружен и в ПНС, и в ППЭС, а плотность апоптозных клеток в ППЭС была выше, чем в ПНС (P < 0.01) на одной и той же стадии развития глаза. Уровень экспрессии GFAP и RT97 увеличивался в ПНС, но уменьшался в ППЭС, тогда как уровень экспрессии Tyr менялся в противоположном направлении и в ПНС, и в ППЭС. Точка пересечения была зарегистрирована через 5—6 ч после образования глазного пузырька. ППЭС становится тоньше, чем ПНС, возможно, благодаря более высокому уровню апоптоза в ППЭС. Молекулярная дифференцировка наблюдалась после контакта наружной стенки глазного пузырька с вышележащей эктодермой, запускающего экспрессию специфических молекул и подавляющего экспрессию неспецифических молекул в ПНС и ППЭС.

Ключевые слова: презумптивная нейральная сетчатка, презумптивный пигментный эпителий сетчатки, апоптоз, дифференцировка, иммунохимия.

ВВЕДЕНИЕ

Сетчатка глаза позвоночных животных берет свое начало от глазных пузырьков, которые возникают в виде двух выпячиваний боковой стенки переднего мозга до его разделения на конечный и промежуточный мозг в ходе зародышевого развития. Глазные пузырьки выпячиваются наружу, достигая эпидермиса и вступая в контакт с его внутренней поверхностью. Затем наружная поверхность глазного пузырька уплощается и вворачивается, образуя двухслойную глазную чашу. Внутренняя стенка глазной чаши гораздо толще наружной стенки, она развивается в нейральную сетчатку. Клетки наружной стенки продуцируют пигмент и развиваются в пигментный эпителий сетчатки (Lopashov, Stroeva, 1961, 1964; Lopashov, 1963; Jacobson, 1966; Hyer et al., 1998; Gilbert, 2003; Francisco-Morcillo et al., 2006).

При изучении механизмов дифференцировки глазной чаши возникает вопрос, почему внутрен-

няя и наружная стенки глазной чаши, которые имеют одинаковое происхождение, дифференцируются, соответственно, в нейральную и пигментную сетчатку. Есть два аспекта дифференцировки глазного пузырька — морфологический и молекулярный, или функциональный.

Морфологическую дифференцировку глазного пузырька описывали и изучали в течение длительного времени (Lopashov, Stroeva, 1961, 1964; Lopashov 1963; Jacobson, 1966; Feng et al., 1984; Martín-Partido et al., 1988; Li, Sakaguchi, 2002; Adler, Canto-Soler, 2007). Описываемые изменения объясняли как результат миграции некоторых клеток из ПНС в ППЭС в ходе раннего развития (ссылки) или как результат пролиферации клеток ПНС (Martín-Partido et al., 1988; Cuadros et al., 1991; Lee et al., 2001). До сих пор нет сведений о различия в уровне апоптоза между ПНС и ППЭС.

Что касается молекулярной или функциональной дифференцировки, исследования касались

различных молекул (Lee et al., 2001; Canto-Soler, Adler, 2006; Adler, Canto-Soler, 2007), однако эти молекулы экспрессировались большей частью до образования глазного пузырька или на поздних стадиях развития глаза (Barnstable, 1987; Harris, Perron, 1998; Zhang et al., 2002). Было общепринято, что молекулярная дифференцировка связана с развитием глаза. Использованные в этих исследования белки (GFAP, RT97 и Tyr) экспрессируются в раннем развитии глаза и участвуют в клеточной дифференцировке глазного зачатка (Holt, 1989; Kumasaka et al., 2003; Shin et al., 2003). Однако до сих пор нет сведений об экспрессии разных белков в ПНС и ППЭС в ходе раннего развития глаза. В настоящем исследовании окраска TUNEL была использована для выявления различий в уровне апоптоза и иммуногистохимия для изучения экспрессии разных белков в ПНС и ППЭС в ходе раннего развития глаза.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные. Жабы Bufo raddei Strauch являются преобладающим видом амфибий на северо-западе Китая. Оплодотворенные яйца жаб собирали в лужах в окрестностях Ланжоу или получали путем искусственного оплодотворения в лаборатории. Зародыши на стадии развития 16—17 (Ge et al., 1982) собирали каждый час и фиксировали в 4% формалине в 0.1 М фосфатном буфере (PBS, pH 7.4) в течение 12—18 ч при 4°С. Затем их обезвоживали в спиртах и просветляли в ксилоле, после чего их заключали в парафин для приготовления срезов.

Плотность клеток на единицу площади. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и изучали под микроскопом Motic B5 с помощью программы Motic Images Advanced 3.0. Срезы рассматривали с помощью программы Photoshop CS3 (10.0), и на той же площади подсчитывали число клеток при одном и том же увеличении в дорсальной, вентральной и центральной областях ПНС и ППЭС, соответственно, через 2, 4, 6, и 8 ч после образования глазного пузырька. Плотность клеток = число клеток/единица площади.

Окрашивание TUNEL. Разрушенную ДНК в клетках выявляли с помощью окрашивания TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase bi-otin-dUTP nick end labeling) (Nanjing KeyGen Biotech. Co. Ltd., China) после облучения в микроволновой печи с раствором цитратного буфера. Срезы промывали 0.1 М PBS, а затем блокировали 3% hydrogen peroxidase-carbinol. После этого срезы инкубировали в 50 мкл буфере, содержащем TDT (terminal deoxynucleotidyl transferase) c Biotin-11-dUTP

при 37°С в течение 1 ч. После промывания в 0.1 М PBS срезы инкубировали в streptavidin-HRP буфере при 37°C в течение 30 мин. Затем срезы снова промывали 0.1 PBS6 визуализировали с помощью диаминобензидина (DAB), еще раз промывали 0.1 М PBS и окрашивали гематоксилином. После проведения в спиртах срезы заключали в нейтральный бальзам и изучали под микроскопом Motic B5. Фотографии срезов собирали с помощью Motic Images Advanced 3.0. В качестве отрицательного контроля использовали 0.1 М PBS для смещения фермента TDT.

Иммуногистохимия. Срезы зародышей и взрослой сетчатки обрабатывали 1 мМ ЭДТА (рН 8.0) в микроволновой печи для восстановления антигена и повторно промывали PBS. Затем срезы последовательно обрабатывали 0.3% перекиси водорода при 37°C в течение 30 мин и в 10% нормальной сыворотки овцы при 37°С в течение 30 мин.

Срезы обрабатывали различными антителами: антимышиными моноклональнымим против GFAP (разведение 1 : 800; Thermo, USA), антимышиными моноклональными против RT97 (1 : 800; Chemicon, USA) и антимышиными моноклональ-ными против Tyr (1 : 700; Thermo). Затем срезы инкубировали с первичными антителами при 4°C в течение ночи. После споласкивания в 0.1 M PBS срезы инкубировали с теми же вторичными антителами (овечьи антимышиные IgG) из двухэтапно-го иммуногистохимического набора (Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co. Ltd., China) при 37°С в течение 30 мин. Срезы снова промывали 0.1 M PBS, визуализировали с помощью DAB, трижды промывали 0.1 M PBS, окрашивали гематоксилином, обезвоживали в серии спиртов и просветляли в ксилоле. Затем срезы заключали в нейтральный бальзам и изучали под микроскопом Motic Images Advanced 3.0. В качестве отрицательного контроля использовали 0.1 М PBS для смещения первичных антител.

Для выявления специфичности антител у жабы использовали взрослую сетчатку.

Компьютерный анализ изображений на интенсивность окрашивания. Фотографии с окрашиванием TUNEL и на иммуногистохимию получали под микроскопом Image 3.0 при увеличении 400х. По крайней мере, десять образцов полученных от десяти различных зародышей рассматривали как одну группу. TUNEL-положительные ядра и имму-ногистохимические данные о белках на срезах количественно обрабатывали с помощью программы Image-Pro 6.0. Область интереса (AOI) была создана и оптическая плотность была измерена. Участки с положительной экспрессией, визуализиро-

14 12 10 8 6 4 2 0

ИППЭС□ПНС

Л шЕп

i MmttM_I_111 II II II II_i_ш__I iïttiftffl_I

2 4 6 8 10 Время, ч

Рис. 1. Плотность клеток в ПНС и ППЭС глазного пузырька в раннем морфогенезе глаза. Данные показывают плотность клеток в ПНС и ППЭС через 2, 4, 6, 8 и 10 ч соответственно, после образования глазного пузырька (п = 10). ** Р < 0.01 считали статистически значимым при сравнении плотности клеток в ПНС и ППЭС на одной и той же стадии развития.

ванные с помощью DAB, были выбраны как AOI. После установления AOI в полученных фотографиях все пиксели в AOI были выбраны и интегральная оптическая плотность (IOD) была измерена соответственно в ПНС и ППЭС (Xavier et al., 2005; Sharma et al., 2006). Значения IOD показывают плотность апоптозных клеток и количественную экспрессию белков.

Анализ данных. Результаты были выражены как среднее ± стандартная ошибка (SD) и оценены в соответствии с критерием Стьюдента. Значения Р < 0.05 рассматривали как статистически значимые между группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Плотность клеток в развивающихся ППЭС и

ПНС. Плотность клеток в ППЭС и ПНС различалась, но эта разница не была статистически значимой до 10 ч после формирования глазного пузырька, когда плотность клеток в ПНС была значительно выше, чем в ППЭС (р < 0.01; рис. 1).

Апоптоз в развивающихся ППЭС и ПНС. Фрагменты разрушенной ДНК выглядели как коричневые скопления в TUNEL-положительных участках, которые располагались в основном около стенки мозга и внутренней поверхности глазного пузырька (рис. 2). На стадии 16 плотность

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком