ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2013, том 450, № 1, с. 116-118
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 616-002-008.953-092
АПОПТОЗ Т-ЛИМФОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ С НАРУШЕНИЕМ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ИММУНИТЕТА ПРИ ПРОВЕДЕНИИ АНТИРЕТРОВИРУСНОЙ ТЕРАПИИ
© 2013 г. Е. В. Сайдакова, Л. Б. Королевская, Н. Г. Шмагель, К. В. Шмагель, академик В. А. Черешнев
Поступило 03.12.2012 г.
Б01: 10.7868/80869565213130288
Широкое внедрение высокоактивной антире-тровирусной терапии (ВААРТ) в практику лечения пациентов с ВИЧ-инфекцией позволило существенно продлить время их жизни [3]. Через три месяца после начала ВААРТ, как правило, отмечается выраженное снижение вирусной нагрузки (менее 500 копий/мл) и нарастание численности СЭ4+-Т-лимфоцитов в крови больных. Уровень последних является определяющим для прогрессирования заболевания [1]. Вместе с тем не у всех пациентов, получающих ВААРТ, наблюдается восстановление численности СЭ4+-Т-лимфо-цитов. Этот феномен получил название "иммунологического неответа". По нашим данным, несмотря на устойчивое подавление вирусной нагрузки, у 11.3% пациентов не происходит увеличения количества СЭ4+-Т-клеток в течение длительного времени [2]. Сходные данные были представлены также другими исследователями [4, 5]. Причины отсутствия восстановления СЭ4+-Т-лимфоцитов при эффективном подавлении репликации ВИЧ остаются неизвестными.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
План исследовательской работы был одобрен этическим комитетом ГКУЗ "ПКЦ СПИД и ИЗ". Каждый пациент дал письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Обследовано 79 ВИЧ-инфицированных пациентов с эффективным снижением вирусной нагрузки (менее 500 копий/мл) на фоне ВААРТ. Исходя из реакции СЭ4+-Т-клеток на терапию больные были разделены на 2 группы: группа с
Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской Академии наук, Пермь
Пермский краевой центр по борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями
иммунологическим ответом (ИО) — пациенты с приростом СЭ4+-Т-лимфоцитов (41 человек: 13 мужчин и 28 женщин); группа иммунологических неответчиков (ИН) — пациенты, не имевшие прироста СЭ4+-Т-лимфоцитов в течение двух лет лечения (38 человек: 21 мужчина и 17 женщин). Группу контроля (К) составили относительно здоровые люди без ВИЧ-инфекции — 21 человек (8 мужчин и 13 женщин). Забор крови осуществляли натощак в пробирки типа "Vacutainer", содержащие ЭДТА.
У всех обследованных были определены: общее количество лейкоцитов и лимфоцитов крови, абсолютное количество CD4+- и СЭ8+-Т-лимфо-цитов (Simultest™, "Becton Dickinson", США), вирусная нагрузка или антитела к ВИЧ (для группы К). Количество копий вируса в крови определяли наборами "Versant HIV-1 RNA 3.0 assay "b" на анализаторе Versant 440, "Siemens". Моно-нуклеары периферической крови выделяли путем центрифугирования в градиенте плотности диа-колла (р = 1.077; "Диа-М") общепринятым методом. Абсолютный и относительный уровни спонтанного апоптоза CD4+- и CD8+-T-лимфоцитов оценивали при одновременном окрашивании реагентами Annexin V-FITC/7-AAD и анти-CD4-PE/анти-CD8-PE (наборы "Beckman Coulter Company", США). Цитометрические исследования проводили на проточном цитофлюориметре FACSCalibur ("Becton Dickinson", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Средний возраст группы ИН составил 34.8 ± ± 0.8 года; пациентов, ответивших на ВААРТ, — 35.8 ± 1.2 года; неинфицированных добровольцев — 32.2 ± 1.9 года (при сравнении всех групп между собой P> 0.05).
Общее число лейкоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов оказалось ниже по сравнению с соответствующим показателем здоровых
АПОПТОЗ Т-ЛИМФОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ
117
30
20
10
(а)
#
** -ь
1
3
300 250 200 150 100 50 0
(б)
###
1
3
Рис. 1. Уровни спонтанного апоптоза СВ4+-Т-лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов в зависимости от реакции иммунной системы на антиретровирусную терапию. По оси абсцисс: 1 — группа контроля, 2 — пациенты с иммунологическим ответом, 3 — группа иммунологических неответчиков. По оси ординат: уровень СВ4+-Т-лимфо-цитов: а — относительное количество, %; б — абсолютное количество, число/мм3.
** Р< 0.01; *** Р< 0.001 относительно контроля; # Р< 0.05; ### Р< 0.001 относительно пациентов с иммунологическим ответом.
0
людей: К - (7514 ± 543) • 106, ИО - (6629 ± 404) • 106, ИН - (5629 ± 269) • 106 кл/мл (РИН -ио < 0.05; Рк-ин < <0.01). Относительное и абсолютное количество лимфоцитов в группе ИН было снижено: К — 32.1 ± ± 1.9% и( 2325 ± 173) • 106 кл/мл; ИО - 33.3 ± 1.6% (Рин-ио < 0.001) и (2080 ± 106) • 106 кл/мл (Рин-ио <
< 0.001); ИН - 25.8 ± 1.7% (РК-ИН < 0.05) и (1418 ± ± 114) • 106 кл/мл (РК-ИН < 0.001). Таким образом, у иммунологических неответчиков по сравнению с группой ВИЧ-инфицированных пациентов, дающих рост СЭ4+-Т-лимфоцитов при назначении ВААРТ, отмечено существенное снижение общего числа лейкоцитов и лимфоцитов крови.
При исследовании СЭ4+- и СЭ8+-популяций Т-клеток получены следующие данные. В группе ИН по сравнению с группами ИО и К было существенно снижено относительное и абсолютное содержание СШ+-Т-лимфоцитов: К - 45.4 ± 1.8% и (1071 ± 102) • 106 кл/мл; ИО - 33.4 ± 1.4% (РИН-ИО <
< 0.001) и (686 ± 58) • 106 кл/мл (РИН-ИО < 0.001); ИН - 22.8 ± 1.5% (РК-ИН < 0.001) и (293 ± 21) • 106 кл/мл (РК-ИН < 0.001). Относительное содержание СЭ8+-Т-лимфоцитов в группе ИН было максимальным и составило 46.7 ± 1.7% (К - 26.7 ± 1.6; ИО - 41.3 ± 1.5% (Рин-ио < 0.05; Рк-ин < 0.001)). Абсолютное количество СЭ8+-Т-клеток в группе ИО было достоверно выше, чем у здоровых людей: ИО - (883 ± 62) • 106, К - (621 ± 66) • 106 кл/мл (РК-ИО < 0.01). Данный показатель в группе ИН составил (693 ± 77) • 106 кл/мл (РК-ИН > 0.05).
При оценке уровня апоптоза СЭ4+-Т-лимфо-цитов впервые было установлено, что у больных с
ВИЧ-инфекцией, не отвечающих на ВААРТ, наблюдался высокий процент спонтанной гибели СЭ4+-Т-клеток, который достоверно превышал соответствующий показатель больных с ВИЧ-инфекцией, стандартно отвечающих на антиретро-вирусную терапию: К - 10.3 ± 0.9, ИО - 13.9 ± ± 0.9% (Рк-ио < 0.01), ИН - 17.5 ± 1.3% (Рк-ин < <0.001 и Рио-ин < 0.05), рис. 1. Вместе с тем при оценке абсолютного количества погибающих СЭ4+-Т-клеток в расчете на 1 мкл крови мы обнаружили обратную зависимость: К - 108.2 ± 15.9, ИО - 90.1 ± 6.7, ИН - 52.9 ± 5.7 кл/мкл (РК-ИН < < 0.001 и РИО-ИН < 0.001). Эти данные, на наш взгляд, не противоречат сделанному выше выводу о высоком уровне спонтанной гибели СЭ4+-Т-клеток у ИН. Низкое значение абсолютного показателя в этой группе пациентов обусловлено глубоким дефицитом СЭ4+-Т-лимфоцитов. В этом и состоит их особенность: даже при низкой численности СЭ4+-Т-клеток темпы их умирания существенно превышают таковые не только здоровых людей, но больных с ВИЧ-инфекцией, дающих прирост Т-лимфоцитов при назначении ВААРТ
При исследовании спонтанного апоптоза СЭ8+-Т-лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов в зависимости от реакции иммунной системы на антиретровирусную терапию получены следующие данные (рис. 2). Относительное количество умирающих клеток в разных клинических группах составило: К - 24.8 ± 2.1, ИО - 27.9 ± ± 1.9, ИН - 27.6 ± 1.6%. Статистически достоверных отличий установлено не было. При этом абсолютное число апоптотирующих СЭ8+-Т-кле-
118
40
30
20
10
(а)
САИДАКОВА и др.
300 г 250 ' 200
150
100
50
(б)
*#
Рис. 2. Уровни спонтанного апоптоза СВ8+-Т-лимфоцитов крови ВИЧ-инфицированных пациентов в зависимости от реакции иммунной системы на антиретровирусную терапию. По оси абсцисс: 1 — группа контроля, 2 — пациенты с иммунологическим ответом, 3 — группа иммунологических неответчиков. По оси ординат: уровень СВ8+-Т-лимфо-цитов: а — относительное количество, %; б — абсолютное количество, число/мм3. * P< 0.05 относительно контроля; # P< 0.05 относительно группы иммунологических ответчиков.
0
3
ток оказалось значительно выше в группе ИО: К - 167.7 ± 31.7, ИО - 249.1 ± 26 кл/мкл (РК-ИО < < 0.05 и РИН-ИО < 0.05), ИН - 181.4 ± 19 кл/мкл (РК-ИН > 0.05 и РИО-ИН > 0.05). Достоверно большее абсолютное число умирающих СЭ8+-Т-лим-фоцитов крови у ВИЧ-инфицированных ИО относительно показателей двух других групп, по-видимому, обусловлено большей численностью этих клеток в циркуляции. Последнее, на наш взгляд, связано с активной реализацией противовирусного ответа на фоне сохраненных резервов иммунной системы. Вместе с тем следует отметить, что уровень апоптоза СЭ8+-Т-клеток был существенно выше уровня апоптоза СЭ4+-Т-кле-ток во всех обследованных группах.
Установление повышенного уровня программной смерти СЭ4+-Т-лимфоцитов у иммунологических неответчиков на ВААРТ по сравнению с аналогичным показателем пациентов, отвечающих ростом числа Т-клеток на антиретровирусную
терапию, является важным фактом, частично объясняющим причину развития иммунологической неотвечаемости на лечение. Механизмы, лежащие в его основе, требуют дальнейшего исследования.
Работа выполнена при поддержке гранта УрО РАН № 12-С-4-1033.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Батрлетт Д., Галлант Д., Фам П. Клинические аспекты ВИЧ-инфекции. 2009-2010. М.: Р. Валент, 2010. 490 с.
2. Шмагель Н.Г., Шмагель К.В., Черешнев В.А. // Инфекционные болезни. 2011. Т. 9. № 1. С. 5-10.
3. Хоффман К., Рокштро Ю. Лечение ВИЧ-инфекции 2009. М.: Р. Валент, 2010. 648 с.
4. Autran B. // Antivir. Ther. 1999. V. 4. Suppl. 3. P. 3-6.
5. Gazzola L, Tincati C, Bellistry M., et al. // AIDS. 2009. V. 48. P. 328-337.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.