БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 5, с. 553 - 559
УДК 612.741
АРАХИДОНОВАЯ КИСЛОТА АКТИВИРУЕТ ВЫБРОС ИОНОВ КАЛЬЦИЯ ИЗ РЕТИКУЛУМА СКЕЛЕТНЫХ МИОТУБУЛ С2С12 ЧЕРЕЗ РИАНОДИНЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ КАНАЛЫ*
© 2014 Э.Р. Муслихов, И.Ф. Суханова, П.В. Авдонин**
ФГБУ Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, 119334 Москва, ул. Вавилова, 26; факс: (499)135-8012, электронная почта: idbras@bk.ru
Поступила в редакцию 04.12.13 После доработки 15.01.14
Арахидоновая кислота вызывает увеличение цитоплазматической концентрации ионов кальция ([Са2+]цит) в дифференцированных многоядерных скелетных миотубулах линии С2С12, но не активирует обмен ионов кальция в миобластах С2С12. В среде без Са2+ ответ миотубул на арахидоновую кислоту сохраняется, что указывает на выброс ионов кальция из внутриклеточных депо. Блокатор рианодинчувствительных каналов саркоплазматического ретикулума дантролен (20 мкМ) подавляет этот эффект на 68,7 ± 6,3% (р < 0,001), ингибитор двупоровых каналов кислых эндолизосомных везикул 1гашМБВ-19 (10 мкМ) снижает выброс Са2+ в ответ на архидоновую кислоту на 35,8 ± 5,4% (р < 0,05), ингибитор фосфолипазы С Ц73122 (10 мкМ) не оказывает влияния. Полученные данные свидетельствуют об участии рианодинчувствительных каналов саркоплазматического ретикулума в вызываемом арахидоновой кислотой увеличении [Са2+]цит в скелетных миотубулах и о возможной вовлеченности в этот процесс двупоровых каналов эндолизосомных везикул.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: ионы кальция, скелетные миотубулы, рианодинчувствительные каналы, арахидоновая кислота.
Ионы кальция играют ключевую роль во множестве процессов, происходящих в живых организмах, начиная от простейших и заканчивая высокоорганизованными млекопитающими и растениями. Со времен зарождения жизни кальций, благодаря своим химическим свойствам, принимает участие в регуляции множества биохимических реакций и физиологических процессов внутри клетки. Концентрация ионов кальция в цитоплазме клеток в состоянии покоя составляет около 100 нМ. При ее повышении запускаются процессы энергетического обмена, секреция, пролиферация и многие другие. В то же время длительное увеличение концентрации Са2+ в цитоплазме токсично для клетки, т.к. может запускать агрегацию белков и нуклеиновых кислот, осаждение фосфатов и нарушение функ-
Принятые сокращения: АК — арахидоновая кислота; ARC — арахидонат-регулируемые каналы, arachidonate-regulated channels; RyR1 — рианодинчувствительные каналы первого типа; TPC — двупоровые каналы, two-pore channels.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 13-341, 06.04.2014.
** Адресат для корреспонденции.
ций клеточных мембран [1, 2]. Поэтому клетка постоянно затрачивает энергию на работу кальциевых насосов для поддержания низкого уровня [Ca2+]w. Ключевую роль в оперативном откачивании ионов кальция из цитоплазмы играет Са2+-транспортирующая АТФаза сарко/эндоплазма-тического ретикулума [3]. Одновременно ретику-лум служит депо для ионов кальция, выполняющих сигнальные функции. Митохондрии также участвуют в поддержании кальциевого гомеоста-за, обладая большой буферной емкостью для этих ионов. В 2002 г. был открыт новый внутриклеточный источник ионов кальция — лизосомы и кислые лизосомоподобные везикулы [4]. Выброс кальция из эндолизосомных везикул осуществляется через особый тип каналов — двупоровые каналы (two-pore channels — TPC), активируемые вторичным мессенджером никотинатаденинди-нуклеотидфосфатом (NAADP) [5]. Физиологическая роль этого кальциевого депо пока мало изучена. Одной из функций эндолизосом является запуск кальций-индуцируемого выброса ионов кальция из ретикулума (calcium-induced calcium release — CICR) [6].
При развитии специализации клеток наряду с морфологическими особенностями появились
свойственные только для определенного типа клеток функциональные системы, регулирующие поступление ионов Ca2+ в цитоплазму. Примером такого рода являются скелетные мио-тубулы — электровозбудимые клетки, в которых выброс ионов кальция происходит через высокоспециализированные рианодинчувствитель-ные каналы 1-го типа (RyR1) [7]. В последние несколько лет установлено, что в дифференцирующихся клетках скелетной мускулатуры, наряду со свойственным для электровозбудимых клеток выбросом ионов кальция из саркоплаз-матического ретикулума в ответ на деполяризацию сарколеммы, реализуются механизмы, обеспечивающие поступление Ca2+ в цитоплазму при опосредованной рецепторами активации внутриклеточных сигнальных каскадов. Удобным объектом для изучения метаболизма ионов кальция в поперечнополосатых мышечных клетках являются скелетные миобласты линии С2С12, которые способны при определенных условиях дифференцироваться в многоядерные миотубулы. По мере дифференцировки мио-бластов С2С12 в миотубулы у них увеличивается экспрессия всех трех видов рецепторов инози-толтрисфосфата [8], и это сопровождается увеличением кальциевого сигнала в ответ на АТР, взаимодействующий с пуринергическими рецепторами P2Y [9]. В скелетных мышечных клетках выявлен характерный для электроневозбудимых клеток депозависимый вход ионов кальция из внешней среды [10, 11]. Было показано, что в депозависимом входе ионов Ca2+ в скелетных миотубулах участвуют каналы Orai1 [12, 13]. Кроме того, было обнаружено, что в миотубулах C2C12 экспрессируется ряд каналов семейства TRP (transient receptor potential channels) [14]. Некоторые из них участвуют в депозависимом транспорте ионов Ca2+, другие — в транспорте в ответ на механические стимулы [15, 16]. Еще один представитель семейства кальциевых каналов Orai — Orai3 также экспрессируется в скелетных мышцах [17]. Известно, что Orai3 входит в состав каналов ARC (arachido-nate-regulated channels), специфическим активатором которых является арахидоновая кислота (АК) [18]. Их активность не зависит от состояния внутриклеточных кальциевых депо. Каналы ARC сформированы тремя молекулами Orai1 и двумя молекулами Orai3, а также белком STIM1, локализованным в плазматической мембране. Каналы ARC выявлены в ряде клеток [18], однако пока неясно, насколько широко распространены эти каналы в разных типах тканей и клеток организма.
Установлено, что липиды, связанные с активностью фосфолипазы A2 — АК и лизофосфа-
тидилхолин, способны регулировать работу кальциевых каналов в различных типах клеток [19, 20]. Оказалось, что одна из изоформ этого фермента, кальций независимая фосфолипаза A2 (iPLA2), участвует в регуляции депозависи-мого транспорта ионов кальция в скелетных миотубулах [21]. По данным Боттин с соавт. [22], активацию депозависимого транспорта ионов кальция в миотубулах вызывает лизофосфати-дилхолин. АК также относят к вторичным мес-сенджерам [20]. АК легко проникает через клеточную мембрану и, высвобождаясь в окружающую среду, может действовать на соседние клетки как паракринный регулятор. Имеются данные о том, что, помимо каналов ARC, АК и ее метаболиты регулируют активность каналов семейства TRP и ряда других Са2+-транспортиру-ющих каналов [23]. В частности, показано, что в некоторых клетках АК активирует рианодинчув-ствительные каналы ретикулума [24]. Итак, на сегодняшний день имеется широкий список возможных мишеней АК, но остается неясным, как она воздействует на внутриклеточный кальциевый обмен в скелетных мышечных клетках.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектом исследования послужили клетки линии C2C12 (скелетные миобласты, полученные из бедра задней конечности мыши, коллекция ATCC). Дифференцировку миобластов в многоядерные миотубулы вызывали заменой среды культивирования (DMEM), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, на среду, содержавшую 2% лошадиной сыворотки. В результате замены среды часть миобластов сливается, образуя протяженные многоядерные миотубулы. В процессе замены среды на диффе-ренцировочную обработка клеток для остановки деления не проводилась, поэтому продолжающие делиться недифференцированные мио-бласты заполняли свободное пространство между миотубулами.
Проводилось окрашивание миотубул после пяти дней инкубации в дифференцировочной среде моноклональными антителами (Developmental Studies Hybridoma Bank, Iowa City, IA, USA) к маркеру миогенной дифференцировки — тяжелым цепям миозина (MHC). В качестве вторичных использовали антитела козы, конъ-югированные с флуоресцентным красителем Alexa Fluor 594 («Molecular Probes», США).
В экспериментах был использован раствор АК («Sigma-Aldrich», США) в смеси с БСА. БСА связывает и стабилизирует АК. Общая концентрация АК в инкубационной смеси составляла 1 мМ,
APAXИДОHОВAЯ ^СЛОТЛ AKTИВИPУET Ж^ЛЬЦ^ВЫЕ KAHЛЛЫ 555
свободная концентрация AK в растворе с БСA составляла менее l0 мкМ, поскольку более 99% AK связано с БСA [23]. В этой области концентраций AK проявляется ее биологическое действие в организме [23]. Тестом для оценки эффективности действия используемого нами препарата AK служила реакция агрегации тромбоцитов человека согласно стандартному протоколу. В экспериментах с миотубулами в качестве контроля использовали раствор БСA без AK.
Исследование влияния AK на концентрацию цитоплазматического кальция ([Ca2+]4H1) проводили в Центре оптических исследований ИБР РЛН с использованием флуоресцентного микроскопа Leica DM 6000 («Leica Microsystems», Германия) в миотубулах, культивируемых в 24-лу-ночном планшете, на пятый день дифференци-ровки. Елетки прокрашивали кальциевым зондом Fura-2/AM («Invitrogen», СШЛ). Для загрузки клеток флуоресцентным зондом их вначале отмывали от среды культивирования физиологическим солевым раствором (physiological salt solution — PSS, pH 7,4), содержавшим 145 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 5 мМ HEPES, 1 мМ MgCl2, 1 мМ CaCl2, 10 мМ глюкозу. После промывки клетки в течение часа инкубировали в среде PSS с Fura-2/AM (2 мкМ) в присутствии 0,04%-ного реагента Pluronic F-127 («Molecular Probes», СШЛ) при комнатной температуре, после чего проводилась отмывка клеток от зонда. Перед измерением флуоресценции проводили инкубацию клеток в PSS в течение часа для полного гидролиза Fura-2/AM в цитоплазме.
Раствор AK и других веществ добавлялся вручную с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.