РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2011, том 5(14), № 1, с. 26-33
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
АССОЦИАЦИЯ ПОЛИМОРФНЫХ МАРКЕРОВ G(-20)A, C(-44)G, ИG^A^^ DEFB1 С РАЗВИТИЕМ ПРЕЖДЕВРЕМЕННЫХ РОДОВ И ВНУТРИУТРОБНЫМ ИНФИЦИРОВАНИЕМ ПЛОДА
© 2011 г. О.А. Ганковская, И.В. Бахарева*, Л.В. Ганковская*, В.В. Зверев
НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;
*ГОУ ВПО РГМУРосздрава, Москва, Россия
Поступила: 11.10.2010. Принята: 25.01.2011
В последнее время большое значение отводится изучению генетической предрасположенности к развитию преждевременных родов у беременных с урогенитальной инфекцией. Целью данной работы являлось исследование ассоциации полиморфных маркеров (G(-20)A, C(-44)G, G(-52)A), локализованных в 5'-нетранслируемой области гена DEFB-1, с реализацией внутриутробной инфекции и с преждевременными родами. Определение исследуемых аллелей проводили с использованием метода ПЦР в режиме реального времени в присутствие TaqMan зондов. Частоты аллелей маркера G(-52)A в группе беременных женщин с преждевременными родами, в группе беременных женщин с реализацией внутриутробного инфицирования плода и в контрольной группе были следующими: аллель G — 0,88, 0,91 и 0,67, аллель А — 0,12, 0,09 и 0,33, соответственно. Риск развития преждевременных родов оказался связан с носителем аллеля G и генотипа G/G. Нами было показано, что гаплотипы G(-20)С(-44), G(-20)A(-52) и C(-44)G(-52) являются «протективными» при беременности с урогенитальной инфекцией. Следует отметить, что гаплотип A(-20)G(-52) связан с развитием преждевременных родов (0R = 2,012). У женщин с гаплотипом G(-20) C(-44)A(-52) урогенитальная инфекция и патологии, связанные с ней развивается значительно реже. Можно считать вышеуказанный гаплотип протективным. Наши исследования и результаты зарубежных авторов указывают на значительную роль полиморфизма гена DEFB1 в восприимчивости организма к инфекциям. Дальнейшее изучение ассоциации полиморфных маркеров в гене DEFB1 и др. может способствовать лучшему пониманию патогенеза инфекционных заболеваний, идентификации подгрупп пациентов которые нуждаются в ином терапевтическом подходе.
Ключевые слова: дефенсин, полиморфизм, врожденный иммунитет, преждевременные роды, внутриутробное инфицирование плода
ВВЕДЕНИЕ
Генетическая предрасположенность к развитию внутриутробного инфицирования и преждевременных родов при урогенитальной инфекции связана с наследованием определенных аллелей генов-кандидатов, т.е. тех генов, белковые продукты которых могут быть вовлечены в развитие заболевания. Для каждого мультифакториального заболевания существует определенный круг генов — кандидатов. В данной работе представлены данные
Адрес: 123557, Москва, Зоологический пер., 8, 100. E-mail: oksgan@yandex.ru
по изучению ассоциации патологии беременности (невынашивание на ранних сроках, преждевременные роды, реализация внутриутробной инфекции плода) с полиморфными маркерами в гене ОЕРБ1. Предполагается, что Р-дефенсин 1 (белковый продукт гена ОЕРБ1) вовлечен в развитие реакций врожденного иммунитета, который является первой линией защиты от инфекции.
ОЕРБ1 локализуется в кластере генов дефен-синов на коротком плече хромосомы 8 в локусе 8р23.2-р23.1 (размер 7,3 кб) (Рис. 1). В отличие от других представителей генов дефенсинов, ОЕРБ1 не имеет дупликаций, что значительно упрощает процесс генотипирования, и неоднозначного генотипирования можно избе-
8 хромосома Кластеры дефенсинов Строение гена DEFB1
Рис. 1. Схематическое изображение локализации кластеров генов дефенсинов
жать [1]. Jurevic R.J. с соавторами предположил, что дефекты или изменения в экспрессии Р-дефенсинов могут быть связаны с различной восприимчивостью к инфекционным агентам и, как следствие, нарушением процессов врожденного иммунитета на уровне слизистых оболочек [2]. Экспрессия HBD-1 в большинстве случаев не индуцируется инфекционными агентами, а изменяется индивидуально. На основании этого была выдвинута гипотеза о том, что увеличение восприимчивости к инфекции может быть связано с генетическим фактором (с полиморфизмом гена DEFB1).
Три SNPs в положениях -52G/A (rs1799946), -44C/G (rs 1800972) и -20G/A (rsl 1362), которые находятся в 5' — нетранслируемой области (UTR) гена DEFB1, не приводили к изменению аминокислотной последовательности, но могли быть связаны с изменением процессов транскрипции или трансляции [3, 4]. Ассоциация данных полиморфных маркеров с патологиями беременности до настоящего времени не исследовалась.
Следовательно, целью данной работы являлось исследование ассоциации полиморфных маркеров (G(-20)A, C(-44)G, G(-52)A), локализованных в 5'-нетранслируемой области гена
DEFB-1, с преждевременными родами и реализацией внутриутробного инфицирования плода.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Проведено клиническое и лабораторное обследование 327 женщин. Возраст всех пациенток находился в интервале от 19 до 42 лет. Первую группу составляли 85 женщин (первый триместр) с неразвивающейся беременностью, закончившейся выкидышем на 5 — 13 недели гестации. Во вторую группу (третий триместр) вошли 148 беременных женщин с урогенитальной инфекцией (УГИ) различной этиологии. Новорожденные от 20 матерей этой группы имели локальные и системные проявления внутриутробной инфекции (ВУИ). Контрольную группу составили 94 беременных с физиологически протекающей беременностью после срочных родов с рождением здорового жизнеспособного ребенка. У всех женщин контрольной группы была исключена урогенитальная инфекция.
Выделение из клеток общей ДНК проводили по известным протоколам [5, 6]. Для детекции ПЦР-продукта использовали флуоресцентные красители, обеспечивающие флуоресценцию прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта [7, 8, 9]. Прайме-ры и зонды для ПЦР-РВ были моделированы в компьютерной программе Vector NTI 8,0 в соответствии с последовательностями исследуемых генов и синтезированы в фирме Синтол (РФ) (Табл. 1). Для приготовления ПЦР-смеси в реакциях использовали Hot Start Taq DNA Polymerase (СибЭнзим, РФ) а также «Набор реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I (Буфер Б)» (Синтол, РФ). Все действия по постановке реакции проводились согласно рекомендациям фирмы-производителя. После приготовления реакционных смесей пробирки помещали в амплификатор для ПЦР-РВ АНК-32 (Институт Аналитического Приборостроения РАН, РФ).
Для статистической обработки результатов по качественным признакам (полиморфным маркерами — сравнение частот аллелей и генотипов) использовали несколько непараметрических критериев: критерий х2 и точный критерий Фишера. Основой статистической обработки данных по полиморфным маркерам был х2 — анализ четырехпольных таблиц распределения аллелей, генотипов и гаплотипов в исследуемых группах. Достоверными счита-
Таблица 1. Системы для определения некоторых SNP гена ББРЫ (номер последовательности в базеNC_000008).
SNP Название праймера/ зонда Последовательность праймера/зонда 5'-
G(-20)A HBD-1 -20 f HBD-1_-20_r HBD-1_-20_z1 HBD-1 -20 z2 gac-gag-gtt-gtg-caa-tcc-acc-a gca-gaa-ggt-agg-aag-ttc-tca-t FAM-tgg-cag-gca-aca-ctc-agg-att-tc-RTQ1 R0X-tgg-cag-gca-aca-ccc-agg-at-RTQ2
C(-44)G HBD-1 -44 z1 HBD-1 -44 z2 R6G-agc-cag-cct-ctc-ccc-agt-tcc-RTQ1 Cy5-agc-cag-cgt-ctc-ccc-agt-tcc-BHQ3
G(-52)A HBD-1 -44 f HBD-1_-44_r HBD-1_-52_z1 HBD-1_-52_z2 gac-gag-gtt-gtg-caa-tcc-acc-ag gca-gaa-ggt-agg-aag-ttc-tca-tgg-cg R6G-ctc-agc-ctc-caa-agg-agc-cag-RTQ1 Cy5-ctc-agc-ctc-caa-aga-agc-cag-BHQ3
лись различия при p < 0,05. Если в исследуемой группе количество значений было невелико, то применяли точный критерий Фишера. Помимо достоверности различия частот, вычисляли отношение шансов (OR), которое характеризует риск заболевания [10].
РЕЗУЛЬТАТЫ
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров G(-20)A, C(-44)G, и G(-52)A гена DEFB1 в группе беременных с физиологически протекающей беременностью, в группе беременных женщин с урогенитальной инфекцией, в группе беременных женщин с УГИ, родивших в срок, в группе беременных женщин с УГИ и с преждевременными родами, в группе беременных женщин с реализованной внутриутробной инфекцией и в группе беременных женщин с невынашиванием на ранних сроках представлены в таблице 2.
При изучении распределения аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-20)A между группами беременных женщин с невынашиванием на ранних сроках, беременных женщин с реализацией ВУИ по сравнению с показателями в группе женщин с физиологически протекающей беременностью были незначительными и носили недостоверный характер. Впрочем, следует отметить, что частота аллелей в группах беременных с УГИ и в контрольной группе составили: аллель G — 0,48 и 0,61, а аллель A — 0,52 и 0,39, соответственно. При этом урогенитальная инфекция у беременных женщин (как со срочными родами, так и с преждевременными родами) была ассоциирована с генотипом G/G.
Различия в распределении аллелей и генотипов полиморфного маркера C(-44)G между
исследуемыми группами были статистически недостоверными (Табл. 2). Таким образом, можно говорить об отсутствии ассоциации полиморфного маркера C(-44)G гена DEFB1 и урогенитальной инфекцией, преждевременными родами, внутриутробным инфицированием и неразвивающейся беременностью.
Анализ частот аллелей и генотипов полиморфного маркера G(-52)A в исследуемых группах выявил некоторые достоверные различия. Так, частоты аллелей данного маркера в группе беременных женщин с УГИ и с преждевременными родами, в группе беременных женщин с реализацией ВУИ и в контрольной группе были следующими: аллель G — 0,88, 0,91 и 0,67, аллель А - 0,12, 0,09 и 0,33, соответственно. Частоты генотипов в группе беременных женщин с преждевременными родами по сравнению с женщинами с нормально протекающей беременностью были следующими: генотип G/G- 0,77 и 0,58, генотип G/A - 0,14 и 0,17, генотип A/A - 0,09 и 0,25, соответственно. Риск развития преждевременных родов оказался связан с носителем аллеля G и генотипа G/G.
На следующем этапе работы была проведена оценка ассоциации гаплотипов с патологией инфекционного генеза при беременности (Табл
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.