БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2013, том 30, № 5-6, с. 462-467
УДК 577.325.7;577.352.33
АУДИОГЕННЫЙ КИНДЛИНГ ИЗМЕНЯЕТ СУБЪЕДИНИЧНЫЙ СОСТАВ BK-КАНАЛОВ В ЗУБЧАТОЙ ФАСЦИИ КРЫС ЛИНИИ КРУШИНСКОГО-МОЛОДКИНОЙ
© 2013 г. Т. А. Савина1*, С. Г. Левин1, И. И. Полетаева2, И. Б. Федотова2, Т. Г. Щипакина1
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Московская область, Пущино, ул. Институтская, 3; *электронная почта: neurochem@mail.ru 2Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 12 Поступила в редакцию 08.05.2013
Изучен субъединичный состав Са2+-активируемых К+-каналов высокой проводимости (ВК-кана-лов) в зубчатой фасции (ЗФ) крыс Вистар и крыс линии Крушинского—Молодкиной (КМ), обладающих наследственной предрасположенностью к аудиогенным судорогам. Показано, что содержание порообразующей а-субъединицы ВК-каналов в ЗФ крыс Вистар и КМ было одинаковым, однако уровень регуляторной р4-субъединицы в ЗФ крыс линии КМ был повышен в 2 раза. Предполагается, что выявленные особенности субъединичного состава ВК-каналов в ЗФ крыс линии КМ могут иметь адаптивный характер и препятствовать развитию гипервозбудимости. Правильность этого предположения подтверждают полученные нами результаты, указывающие на изменение а/в4 субъединичного состава ВК-каналов в ЗФ крыс линии КМ через различное время после аудиогенного киндлинга (модель височной эпилепсии). Так, через 3 и 14 сут после киндлинга содержание а-субъединицы в ЗФ крыс линии КМ увеличивалось примерно в 2.5 раза. Уровень Р4 через 3 сут после киндлинга в ЗФ крыс линии КМ, напротив, снижался до 30% от уровня в ЗФ крыс КМ интактной группы; к 14 сут наблюдалось дальнейшее снижение содержания Р4. Предполагается, что хронические судороги, вызывая изменения субъединичного состава ВК-каналов в ЗФ крыс, могут изменить функциональные свойства ЗФ в качестве физиологического фильтра, в норме препятствующего распространению эпилептиформной активности в гиппокамп.
Ключевые слова: аудиогенные судороги, гипервозбудимость, эпилепсия, каналопатии, ВК-каналы.
Б01: 10.7868/80233475513050162
Са2+- и потенциал-регулируемые К+-каналы большой проводимости (ВК-каналы), локализованные на центральных глутаматергических нейронах млекопитающих могут вовлекаться в развитие нейрональной гипервозбудимости и патофизиологию эпилепсий [1—4]. К+-токи, осуществляемые через ВК-каналы, определяют гиперполяризацию мембраны, регулируя спайковую активность нейронов. Мембранные ВК-каналы обладают наибольшей среди всех К+-каналов проводимостью для ионов К+, они активируются двумя независимыми сигналами: деполяризацией мембраны и внутриклеточными ионами Са2+ в диапазоне концентраций от сотен наномолей до десятков микромолей [1, 5, 6]. Физиологическая функция ВК-каналов зависит от субъединичного состава канального комплекса. Основной компонент функциональных ВК-каналов представлен тетрамером поро-образующих а-субъединиц. В канальный комплекс также может входить одна из регуляторных
р-субъединиц (р1—р4), причем р4-субъединица является нейроспецифичной [5, 7]. Регуляторные р-субъединицы определяют транспорт BK-кана-лов в плазматическую мембрану нейронов [8], кинетику активации каналов и их чувствительность к фармакологическим агентам. ВК-каналы локализованы на соме, дендритах, а также на преси-наптических окончаниях нейронов. Пресинапти-ческие BK-каналы регулируют высвобождение глутамата [9]. В постсинаптических компартмен-тах BK-каналы участвуют в реполяризации потенциала действия и генерации быстрой фазы следовой гиперполяризации [10, 11].
Несмотря на интенсивные исследования, проводимые в последние несколько лет, роль BK-ка-налов in vivo остается во многом неясной [12—14]. Согласно [3], BK-каналы в физиологических условиях практически не участвуют в регуляции активности нейронов, однако при повышенной
возбудимости, травмах и ишемии наблюдается увеличение их активации. Известно, что в условиях повышенной нейрональной активности ВК-каналы контролируют высвобождение глута-мата, при этом увеличение их уровня и/или их гиперактивация приводят к увеличению частоты разряда нейронов, появлению пачечной активности и развитию гипервозбудимости [3, 9]. С другой стороны, в настоящее время ВК-каналы, содержащие р4-субъединицу, рассматриваются как один из ключевых механизмов, определяющих частоту разрядов нейронов в различных структурах головного мозга, в частности, в зубчатой фасции (ЗФ) [15].
ЗФ представляет собой интегральную часть важнейшей функциональной системы мозга — гиппокампальной формации [16]. В ЗФ оканчивается перфорантный путь, идущий из энториналь-ной коры, который является основным глутама-тергическим входом в гиппокамп. Считается, что в норме ЗФ выполняет роль "физиологического фильтра", пропускающего в гиппокамп только низкочастотные сигналы за счет синаптического инги-бирования при участии тормозных ГАМКергиче-ских нейронов и препятствующего развитию гипервозбудимости в гиппокампе [17, 18]. В настоящее время предполагается, что именно изменение субъединичного состава мембранных ВК-каналов является важным регулятором функции ЗФ [15].
Цель нашей работы состояла в изучении роли ВК-каналов в механизмах наследственной предрасположенности к судорогам и в развитии хронической судорожной активности. Для ответа на эти вопросы проведен сравнительный анализ субъединичного состава (а- и р4-субъединиц) ВК-каналов в ЗФ крыс линии Крушинского-Мо-лодкиной (модель наследственных судорог, вызываемых звуком) и крыс Вистар, нечувствительных к инициации аудиогенных припадков. Дополнительно оценили содержание а- и р4-субъединиц ВК-ка-налов в ЗФ крыс линии КМ через различное время после аудиогенного киндлинга — модели височной эпилепсии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Экспериментальные животные. Работа выполнена на трехмесячных самцах крыс Вистар (получены из вивария ИТЭБ РАН, Пущино) и крыс линии Крушинского—Молодкиной (КМ), обладающих предрасположенностью к аудиоген-ным судорогам, вызываемым звуком. Крысы линии КМ получены из Лаборатории физиологии и генетики поведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова (Москва). Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к пище и воде. Все опыты проводили в соответствии с нормативными документами, рекомендованными Европейским науч-
ным фондом (86/609/EC), и правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 № 755).
Аудиогенный киндлинг. Для развития хронических судорожных припадков крыс линии КМ подвергали действию звука (80 дБ, 12—15 кГц) по протоколу — 20 судорог, одна судорога в день, 6 дней в неделю (аудиогенный киндлинг). Всего в работе были использованы четыре группы животных: 1) крысы Вистар (n = 6), отобранные по признаку нечувствительности к действию звука;
2) КМ — интактные крысы линии КМ (n = 6),
3) АКМ3 — крысы линии КМ через 3 сут после окончания аудиогенного киндлинга (n = 7) и
4) АКМ14 — крысы линии КМ через 14 сут после окончания аудиогенного киндлинга (n = 7).
Электрофорез и вестерн-блотинг. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом, головной мозг помещали в раствор (4°С), содержащий 0.32 М сахарозу, 5 мМ трис, pH 7.4, 1 мМ EDTA и 1 мМ EGTA, выделяли правый и левый гиппокампы. Из поперечных срезов каждого гип-покампа выделяли ЗФ, ткань в дальнейшем хранили в жидком азоте. Ткань гомогенизировали на льду в буфере, содержащем 50 мМ HEPES pH 7.4, 10 мМ EGTA, 5 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитола 1 мМ PMSF, 10 мкМ бензамидин, 5 мкг/мл апро-тинина, 10 мкг/мл леупептина и 10 мкг/мл анти-паина. Содержание белка в пробах определяли по методу Брэдфорд [19].
Образцы ткани для электрофореза подготавливали как описано ранее [20]. Для иммунохими-ческих исследований аликвоты гомогенатов ЗФ разделяли в 10% SDS-ПААГ (15 мкг белка на трек). В каждом конкретном случае на одном геле разделяли белки гомогенатов гиппокампа животных контрольной и одной из опытных групп. После разделения в SDS-ПААГ белки переносили при помощи аппарата Mini-PROTEAN 3 Cell (Bio-Rad, США) на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0.45 мкм в буфере, содержащем 25 мМ трис рН 8.3, 193 мМ глицин, 20% метанола, 0.5% SDS.
Иммунное проявление реплик осуществляли согласно [20]. Для определения содержания белков были использованы поликлональные антитела против а-субъединицы BK-каналов (Anti-KCa1.1, IgG сыворотки кролика, разведение 1 : 250, Alamone Labs, Израиль), поликлональные антитела против ß4-субъединицы ВК (Anti-sloß4, IgG сыворотки кролика, разведение 1 : 250, Alamone Labs, Израиль), поликлональные антитела против глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) как контроля на внесение одинакового количества белка (IgG кролика, разведение 1 : 10000, Sigma-Al-drich, США) и вторичные антитела, конъюгиро-ванные с пероксидазой хрена (IgG козы, разведе-
464
САВИНА и др.
2
кДа 140
100 70
кДа 25
15
Рис. 1. Специфичность антител, используемых для выявления а- (а) и Р4- (б) субъединиц ВК-каналов в гомогенатах ЗФ крыс. 1 — Проявление белковых полос с помощью антител; 2 — антитела были преинкубиро-ваны в течение 1 ч с соответствующим антигеном. Справа показано положение белковых маркеров.
а
GAPDH
ß'
Вистар
КМ
я и
я
и
300
tfl
vo ^
с
<ч
§200 а
я
а к
о К
р100
ч о
С
0
Рис. 2. Детекция методом иммуноблотинга а- и Р-субъ-единиц ВК-каналов в гомогенатах ЗФ крыс линии КМ (п = 6) и Вистар (п = 6). Содержание субъединиц в ЗФ крыс Вистар принято за 100%. а — Вестерн-блоты; б — сравнительный анализ содержания субъединиц ВК-ка-налов в ЗФ крыс исследуемых групп. Оптическая плотность белковой полосы, соответствующей GAPDH, в образцах не различалась. Различия между группами статистически значимы прир < 0.05 — *; прир < 0.01 — **.
ние 1 : 20000, Bio-Rad, США). В качестве дополнительного контроля при иммунохимическом проявлении также использованы специфические антигены против соответствующих антител: пептид sloß42-17 (0.4 мкг против 1 мкг антител Anti-sloß4, Alamone Labs, Израиль) и связывающий белок KCa1.1-GST (3 мкг прот
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.